壬基酚对P450arom和MIS基因表达的影响

[目的]研究壬基酚(p-nonylphenol,NP)对细胞色素P450芳香化酶基因(P450arom)和苗勒氏管抑制物基因(MIS)表达的影响,探索其对鱼类雌激素样作用的分子机制。[方法]日本比目鱼在性分化过程中能随环境因子改变而发育为不同性别,在幼鱼孵化后第30天到第100天性分化敏感期于27℃水温下,给予幼鱼投食NP 100μg/g饲料。分别对各组比目鱼生殖腺做病理组织切片,判断其性别和雌雄比例,并通过原位杂交方法结合RT-PCR分析第100天青年期鱼生殖腺中P450arom和MISmRNA的表达,观察NP对比目鱼性分化标志基因的作用。[结果]NP对27℃水温饲养下的比目鱼幼鱼有一定程度的雌性化诱导作用,成年雌性的百分比为30%,高于27℃水温对照组(0%);比目鱼幼鱼出生后第100天时对其生殖腺进行原位杂交分析显示,P450arom的mRNA在各组的雌鱼卵巢中有明显表达,但在雄鱼精巢中未见表达;而MIS的mRNA在各组的雌鱼卵巢中不表达,却在雄鱼精巢中能见到很明显的表达。RT-PCR分析也显示,P450芳香化酶的mRNA仅仅在雌鱼卵巢中表达,而MIS也仅仅在雄鱼精巢中表达,证实了原位杂交实验的结果。[结论]在日本比目鱼体内,NP染毒可以诱导P450芳香化酶mRNA表达并抑制MIS的mRNA的表达,从而对生殖腺性分化期的幼鱼发挥雌激素样干扰作用。

隐睾患儿血清抗苗勒管激素水平研究

目的分析不同年龄及不同类型隐睾患儿血清抗苗勒管激素(AMH)水平差异,探讨其在睾丸发育评价中的作用。方法选择60例单纯性隐睾患儿为病例组,52例健康体检儿童为对照组,分别检测两组儿童血清AMH水平,并比较两者之间的差异。结果 (1)病例组AMH水平低于对照组(P<0.05),>6~11岁隐睾患儿与健康儿童间差异无统计学意义(P>0.05)。(2)双侧隐睾组AMH水平低于单侧隐睾组(P<0.05),>6~11岁双侧隐睾与单侧隐睾患儿间差异无统计学意义(P>0.05)。(3)高位型隐睾组AMH水平低于低位型隐睾组(P<0.05),>3~11岁高位型隐睾和低位型隐睾患儿间差异无统计学意义(P>0.05)。(4)AMH水平与年龄呈负相关性,与睾丸发育情况呈正相关性。结论 AMH可作为反映隐睾患儿睾丸发育状况的一项重要指标。

重组人苗勒抑制物对2株卵巢癌细胞增殖的抑制作用

目的:探讨重组人苗勒抑制物(rhMIS)对人卵巢癌细胞株OVCAR8及SKOV3细胞生长的影响。方法:Western blotting检测细胞中MISII型受体(MISIIR)蛋白表达,激光共聚焦显微镜观察MISIIR蛋白在细胞中定位。rhMIS分别干预2株卵巢癌细胞,四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测细胞增殖变化;软琼脂克隆实验检测细胞体外成瘤性;流式细胞术分析rhMIS对细胞凋亡和细胞周期影响。结果:OVCAR8细胞表达MISIIR蛋白,其定位于细胞表面及细胞质中,SKOV3细胞中MISIIR蛋白表达缺损。经rhMIS作用48h后,OVCAR8细胞的生长速率显著减慢、细胞体外成瘤性明显降低、细胞发生凋亡和G1期细胞增加,rhMIS(10mg/L)干预后细胞凋亡率和G1期细胞比率分别可高达(31.3±2.1)%和(70.4±3.0)%,与SKOV3细胞比较差异显著(P<0.01)。结论:重组人苗勒抑制物可以抑制MISIIR蛋白表达的卵巢癌细胞增殖、诱导其凋亡、阻滞细胞周期,这有望成为治疗卵巢癌的一个新靶点。

苗勒抑制物作为卵巢功能指标的临床重要性

苗勒抑制物与卵泡的起始募集关系密切,能够随卵巢功能的改变而最先变化。因此,它可作为诊断卵巢功能的一个重要指标,标记不同女性的月经周期和每个妇女自身月经周期的最小变化,并随时提供与卵巢功能有关的重要信息。针对苗勒抑制物的水平对卵巢功能起到评估作用,集中讨论苗勒抑制物在体外受精诱导排卵的过程中是否可对卵巢功能起到预测作用,是否能评估发生卵巢过度刺激综合征的危险性,以及苗勒抑制物作为诊断多囊卵巢综合征的一个准确而重要的新指标在临床应用中的可行性。

重组人谬勒管抑制素/抗谬勒管激素国际参考试剂协作研究

血清谬勒管抑制素/抗谬勒管激素(AMH)水平可用于评估卵巢储备功能,辅助诊治相关疾病。世界卫生组织(WHO)生物标准化专家委员会在2018年制备了编号为16/190的AMH国际标准品候选品,并开展了协作标定,中国食品药品检定研究院应邀参加。按照WHO研究方案,采用多种化学发光法、酶联免疫法、酶联免疫荧光法和免疫荧光层析法进行标定。全球4个国家7个实验室提交了数据。结果显示,AMH国际候选标准品的免疫效价在282~1157 ng·安瓿^(-1)内,几何均值为511 ng·安瓿^(-1)[95%CI:426~612 ng·安瓿^(-1),n=16,均数变异系数(GCV)=42%],稳健均值为489 ng·安瓿^(-1),且稳定性满足要求。本实验室提交的免疫效价几何均值为448 ng·安瓿^(-1)(95%CI:377~531 ng·安瓿^(-1),n=8,GCV=23%),与WHO总结数据的相对偏差为-12.3%。因候选标准品与患者标本在多个方法中不具有互换性,且各种协作方法得到的结果存在较大差异,经WHO生物标准化专家委员会审核,确定16/190为人重组勒管抑制素/AMH第1次国际参考试剂,每安瓿489 ng。

邻苯二甲酸二丁酯雄性生殖毒性分子作用机制

目的研究邻苯二甲酸酯类对大鼠睾丸毒性作用的分子机制。方法运用RT-PCR方法观察邻苯二甲酸二丁酯(DBP)对大鼠子代不同发育阶段睾丸的苗勒氏管抑制物质(MIS)、雄激素结合蛋白(ABP)和抑制素(inhibin)表达水平的影响,并采用ELISA法检测DBP染毒后大鼠睾酮水平的变化情况。结果与对照组比较,各DBP染毒组大鼠睾丸中MIS表达差异无统计学意义,血清总睾酮水平差异无统计学意义,但高剂量DBP(1000 mg/kg)组睾丸支持细胞中ABP和抑制素(inhibin)的mRNA表达量显著减少,且与睾丸损害呈时间-效应关系。结论环境内分泌干扰物DBP可干扰大鼠发育过程中睾丸支持细胞ABP和inhibin的表达,其对性腺发育的影响可能是DBP雄性生殖毒性的主要作用机制之一。

MISⅡR启动子的克隆及其组织特异性鉴定

目的克隆苗勒氏管抑制物Ⅱ型受体启动子(mullerian inhibiting substance typeⅡreceptor promoter,MISⅡRpr)并鉴定其在卵巢器官中的特异性表达活性。方法利用PCR从C57BL/6小鼠基因组中扩增苗勒氏管抑制物Ⅱ型受体启动子并将其克隆入载体pMD18-T,测序正确后将其亚克隆入pGL3-Basic荧光素酶报告基因载体。将重组质粒pGL3-Basic/MISⅡRpr分别转染卵巢癌细胞系SKOV3、HT-8910,宫颈癌细胞系Hela、Si Ha,绿猴肾细胞系COS-7,乳腺癌细胞系MDA-MB-231和结肠癌细胞系HT-29,通过双荧光素酶检测系统检测荧光素酶在上述细胞系中的活性,以确定克隆的苗勒氏管抑制物Ⅱ型受体启动子是否具有卵巢特异性活性。结果构建的pGL3-Basic/MISⅡRpr质粒用SacⅠ和EcoRⅠ双酶切,片段大小分别为600 bp和1 000 bp,证明MISⅡRpr插入正确。重组质粒转染卵巢细胞系SK-OV3、HT-8910,荧光素酶高表达;对照细胞HT-29等转染后,荧光素酶低表达。结论克隆得到的MISⅡRpr具有明显的卵巢特异性活性。可以利用MISⅡRpr进行相关基因的卵巢特异性表达。

隐睾患儿体内苗勒氏抑制物和睾酮的变化

目的明确隐睾患儿体内苗勒氏抑制物(MIS)和睾酮的变化、相互关系并探讨其机制。方法瑞金医院儿外科1～14岁住院男孩分为病例组(隐睾)43例、对照组(非泌尿系统疾病)98例。两组按年龄段各分为3个亚组:1～3岁、4～11岁、12～14岁,按亚组分别比较两组MIS和睾酮值;以及两组MIS与睾酮的相关性。结果1～3岁隐睾儿童MIS低于对照组,4～11岁与对照组相似,12～14岁高于对照组;1～11岁组隐睾儿童睾酮与对照组相似,12～14岁低于对照组;两组MIS与睾酮均呈明显负相关。结论低年龄隐睾儿童MIS低于正常,青春前期隐睾儿童MIS高于正常、睾酮低于正常。低年龄儿童MIS过低,青春前期MIS过高或睾酮过低,都可暗示睾丸结构功能异常。

小儿血清苗勒抑制物质水平变化及其临床意义

通过测定非泌尿生殖系统疾病及隐睾患者的血清苗勒抑制物质 (MIS)值 ,观察年龄与MIS的相关性。结果男性非泌尿生殖系统疾病患儿血清MIS值随年龄增长而下降 ,女性儿童血清MIS值明显低于男性 ,且不随年龄变化 ,青春发育前期隐睾儿童血清的MIS值高于同龄儿。