Development of Multi-PCR for Differentiation of Vaccine Strain and Field Isolate of Porcine Pseudorabies Virus

Three pairs of primer were designed for amplification of porcine pseudorabies virus （PRV） gB, gE, and TK gene by multiplex PCR （multi-PCR） in order to differentiate vaccine strains from field isolates. Three specific bands were obtained respectively at the expected size, 427 bp （gB gene）, 298 bp （gEgene）, and 208 bp （TKgene）, Then four different gene-deleted vaccines of PRV were detected by multi-PCR. One ex- pected specific band was observed in one of samples, while two bands in the others. As shown by the detection results, the multi-PCR has high sensitivity and specificity and should be applied in pathogen diagnosis and epidemiological investigation in the future.

散养土鸡J亚群禽白血病病毒和网状内皮组织增生症病毒混合感染的诊断

湖北某农户散养的土鸡,鸡群精神委靡、整体消瘦,对病鸡进行剖检,发现部分鸡体表和脏器可见大小不等的肿瘤结节。取病变典型的组织制作病理切片,镜检可看到髓样细胞瘤和网状细胞。提取病鸡组织DNA,用两组Multi-PCR分别检测A、B、J亚群禽白血病病毒(ALV-A、ALV-B、ALV-J)和马立克病病毒(MDV)、禽网状内皮增生症病毒(REV)。结果仅扩增出与ALV-J和REV相应的条带,表明该鸡群为ALV-J和REV混合感染。

重症监护病区碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌的主动筛查及基因分析

目的调查重症监护病区(ICU)患者在住院期间碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌(CRE)主动筛查菌株的分布以及CRE耐药基因的检测和分析。方法收集424例ICU患者直肠拭子、咽拭子和腹股沟拭子样本,采用肉汤增菌法进行CRE阳性病例的主动筛查,全自动药敏分析仪进行体外药敏试验,PCR法检测碳青霉烯酶耐药基因,通过多位点序列分型(MLST)和肠杆菌基因间重复共有序列PCR分析CRE菌株的同源性关系。结果直肠拭子、咽拭子和腹股沟拭子CRE筛查阳性率分别为12.5%、5.0%和4.2%,CRE菌株主要来自肺炎克雷伯菌(82.6%)、大肠埃希菌(9.8%)和产气肠杆菌(4.3%),CRE菌株对替加环素、头孢他啶阿维巴坦敏感性较好(>90%);92株CRE碳青霉类耐药基因检测,以blaKPC-2亚型(91.3%)为主;MLST分型结果显示76株碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌(CRKP)主要为ST11型(69.7%)和ST15型(28.9%);ERIC-PCR扩增结果分析显示,76株肺炎克雷伯菌主要为谱型A(69.7%)和谱型B(28.9%)。结论ICU住院患者CRE主动筛查以blaKPC-2亚型的CRKP为主,MLST分型和ERIC-PCR扩增结果聚类分析发现主要存在两个克隆株传播。

多重PCR筛选临床细菌耐药整合子基因

目的:建立多重PCR方法并对临床菌株进行扩增及整合子分类。方法:采用多重PCR对21株来自临床的耐药菌株进行了第一、二和三类整合酶基因(intI)筛选。结果:16株携带第一类整合酶基因;1株携带第一和第二类整合酶基因;2株含第二类整合酶基因;1株含第三类整合酶基因;1株不含第一、二和三类整合酶基因。结论:筛选细菌耐药整合子基因分类的多重PCR方法简便可靠;整合子广泛存在于临床耐药细菌中。

犬瘟热、犬冠状病毒联合RT-PCR检测方法的建立及应用

用CDV、CCV特异性引物对同一样品中CDV和CCVRNA模板进行联合RT PCR扩增 ,并对扩增条件进行了优化。结果同时得到了两条大小与试验设计完全相符的特异性扩增带 ,且不扩增犬细小病毒、犬腺病毒、犬副流感病毒、轮状病毒的核酸。敏感性试验表明 ,该联合PCR能检测出 10 - 4倍稀释的CDV模板 (10 6 6 TCID50 / 0 1mL)和 10 - 3倍稀释的CCV模板 (10 5 9TCID50 /0 1mL)。通过对 7份临床发病犬病料的检测 ,其阳性检出率高于电镜负染检查。初步应用表明 ,此法具有高度敏感、特异、准确、快速等特点 ,适用于兽医临床对CDV。

分子标记辅助培育水稻抗白叶枯病和稻瘟病三基因聚合系

水稻的白叶枯病和稻瘟病是水稻的两大主要病害，通过分子标记辅助选择与传统的杂交、自交相结合的方法，将抗稻瘟病的Pi9（t）基因和抗白叶枯病的Xa21及Xa23基因聚合到同一株系中，经多代大田或／和温室接菌鉴定、室内标记选择和田间农艺性状的筛选，获得了4个三基因聚合且农艺性状优良的株系L17-L20。用不同国家和地区的20个稻瘟病小种、中国流行的7个白叶枯病菌系c1-c7以及安徽省流行的白叶枯病菌系进行大田或，和温室抗病性鉴定，结果显示，株系L17-L20对20个稻瘟病小种均表现出抗性，抗性水平与Pi9（t）基因的供体亲本75-1-127相当，抗谱相同；对白叶枯病的抗性和抗谱与Xa23基因相似，不论在苗期还是在成株期均抗白叶枯病。与Xa21、Xa23基因的供体亲本M12和CBB23相比，成株期的抗性水平有所增强。利用多重PCR技术，在同一PCR反应中可同时选择Pig（t）和Xa21基因，提高了PCR选择效率。

嗜麦芽寡养单胞菌中Ⅱ类整合酶基因的发现及意义

目的检测Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类整合子在嗜麦芽寡养单胞菌临床分离株中存在情况,分析整合子对细菌耐药性的影响。方法应用多重PCR方法筛选嗜麦芽寡养单胞菌整合酶基因。结果Ⅰ类整合子的检出率为13.4%,其中3株菌同时带有Ⅰ类和Ⅱ类整合子,Ⅱ类整合子的阳性率为3.6%,未检测到Ⅲ类整合子。结论嗜麦芽寡养单胞菌中主要分布Ⅰ类整合子,首次发现嗜麦芽寡养单胞菌中含有Ⅱ类整合子,Ⅱ类整合酶基因可能增加细菌多药耐药的发生。

多重PCR技术鉴定番茄Ty-1和Mi基因

利用同一PCR反应体系,对分别与番茄(Lycopersion esculentum)抗黄化曲叶病毒(Tomato YellowLeaf Curl virus)病的Ty-1基因和番茄抗根结线虫(root-knot nematode)的Mi基因紧密连锁的SCAR标记进行同时扩增筛选,扩增的特异性片段与单引物扩增片段完全吻合。与Ty-1基因紧密连锁的SCAR1标记为共显性标记,抗感材料均产生398bp的特异片段,纯合和杂合抗病基因型存在Taq I酶切位点,酶切后分别产生了303bp和95bp以及398bp、303bp和95bp的特异性片段,而感病基因型无此酶切位点。与Mi基因紧密连锁的SCAR2标记也为共显性标记,抗感材料均产生750bp的特异片段,纯合和杂合抗病基因型存在Taq I酶切位点,酶切后分别产生了570bp和180bp以及750bp、570bp和180bp的特异性片段,而感病基因型无此酶切位点。酶切结果仍为750bp的产物。经反复验证,结果准确可靠,可以用于在同一PCR反应体系中对两个抗病基因进行同时筛选鉴定。

用多重PCR快速检测登革病毒并分型

目的 建立一种多重聚合酶链反应 (PCR)方法 ,对不同型别登革病毒进行快速检测及分型。方法 采用 4种型别登革病毒通用的外侧引物进行逆转录PCR(RT PCR)反应 ,继用 4对 (5种 )型特异引物在单管内进行巢式PCR ,依据扩增产物的片段大小进行分型。结果 采用多重PCR ,扩增出 4 82、119、2 90及 392bp的特异片段 ,分别代表登革病毒 1～ 4型。结论 该方法快速、敏感、特异 ,有一定的推广应用价值。

细菌耐药整合子intI分类的多重PCR方法的建立及应用

目的建立快速筛选细菌耐药整合子的分类方法,并对21株来自临床的菌株进行整合子筛选和分类。方法根据G enB ank/EM BL内的第一、第二和第三类的整合酶序列,通过软件C lustalW的多重比对分析设计出各类整合子的特异性引物,用对照菌株建立多重PCR方法并对21株临床菌株进行PCR扩增,通过其PCR扩增产物片段大小的不同进行整合子分类。结果对照菌株实验结果显示,21株临床分离菌株中,15株在565bp处有扩增片段,即为含有第一类整合酶基因;4株在403bp处有扩增片段,即含有第二类整合酶基因;1株在565bp和403bp处均有扩增片段,提示其同时含有第一、二类整合酶基因;1株没有得到任何扩增片段,即不含有这三类整合酶基因;在被测菌株中未发现第三类整合酶基因的阳性菌株。结论本文报道的筛选细菌耐药整合酶基因分类的多重PCR方法效果良好,具有可行性,为更加全面细致研究整合子类型以及整合子介导的细菌耐药机制提供了一种简单易行、快捷有效的方法。

布鲁菌种属鉴定多重PCR方法的建立及初步应用

用BCSP31作为布鲁菌属特异性基因,以IS711基因拷贝数差异作为布鲁菌种间特异性标志,建立了布鲁菌种属特异性的多重PCR鉴定方法。用建立的多重PCR方法对11株(牛种A19,A544,A387;羊种M111,M28,M16;犬种RM6/66;绵羊种63/290;猪种S2,rS2,S1330)不同种来源的布鲁菌菌体和基因组进行鉴定,结果牛种菌能扩增大小分别为494,223,178bp3条带,羊种菌能扩增出大小分别为733,223,178bp3条带,犬种菌能扩增出大小分别为223,178bp2条带,绵羊种菌能扩增出大小分别为976,223,178bp3条带,猪种菌能扩增出大小分别为285,223,178bp3条带,均与预期一致;而作为对照的大肠杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌、流产沙门菌和都柏林沙门菌,均未扩增出任何条带。结果表明,本研究所建立的方法具有良好的特异性,能够区分不同种源的布鲁菌,可用于布鲁菌种属的快速鉴定和流行病学调查。

多重PCR方法快速鉴别猪伪狂犬疫苗毒和野毒

根据Genbank中PRV的gB、gE、TK基因序列设计并合成引物,对样品中PRVDNA进行多重PCR扩增及反应条件优化,得到与设计相符合的3条特异性条带,分别为427 bp(gB)、298 bp(gE)和208 bp(TK)。用这3对引物对四种伪狂犬疫苗样品DNA进行多次多重PCR扩增,其中1种疫苗得到与设计相符的1条特异性条带,其余为2条。该结果表明,此检测方法敏感度较高,适用于科学研究、临床诊断以及流行病学调查,对根除伪狂犬病具有重要意义。

假单胞菌属细菌中整合子的分布及其可转移耐药性研究

目的研究临床分离假单胞菌属细菌中Ⅰ、Ⅱ类整合子分布及其可转移耐药情况。方法将Ⅰ、Ⅱ类整合酶基因通用引物置于同一反应体系,对假单胞菌属细菌以多重PCR法检测其整合子的分布,并对整合酶基因阳性菌进行接合转移,最后对接合转移成功菌以平板稀释法测其临床株和接合子MIC值。结果Ⅰ类和Ⅱ类整合酶基因在临床分离假单胞菌属细菌中检出率分别为38.1%和2.2%,含整合酶基因的接合子在转移成功接合子中所占比率为13.6%。结论Ⅰ类整合子在假单胞菌感染的临床分离株中所占比例已相当高,但水平传播率还较低。

犬腺病毒、犬细小病毒联合PCR方法的建立与应用

根据GenBank报道的犬腺病毒(CAV)和犬细小病毒(CPV)序列,设计两对联合PCR引物,其中一对为CAV-1和CAV-2通用引物,另一对为CPV引物。在建立单项PCR基础上,通过优化Mg2+离子浓度和循环参数等反应条件建立联合PCR,确定联合PCR条件为:96℃180s,96℃30s,56℃30s,72℃80s,30个循环。联合PCR结果显示:CAV-1扩增片段大小为497bp,CAV-2为1019bp,CPV为719bp;细胞和其它相关病毒对照均无扩增带。上述PCR产物经用限制性内切酶酶切和克隆测序,结果均与相应病毒的应有条带和序列相同。敏感性比较试验结果表明,联合PCR比用细胞培养分离病毒敏感。将联合PCR应用于15份CAV和CPV细胞培养物,5份CAV-1、1份CAV-2和3份CPV人工感染犬病料以及30份临床病料检测,并与电镜负染、HA/HI及病毒分离等方法的结果进行比较,结果显示,联合PCR的检出率和病毒分离结果一致,高于电镜负染和HA/HI试验。以上结果说明:CAV-1/CAV-2和CPV联合PCR不仅具有很好的特异性和敏感性,而且可以在短时间内(2 5h～3h)同时鉴定出上述三种病毒,因此具有良好的实验室诊断和临床应用价值。

应用多重PCR法分析西藏察隅疟疾流行区按蚊吸血习性

目的用多重PCR法分析西藏疟疾流行区察隅县常见按蚊的吸血习性,为下一步研究传疟媒介提供参考。方法2011年7~8月选择察隅县不同生态环境的3个自然村（日玛村、塔玛村和京都村）,每个村在人房和畜舍选择8个点,采用诱蚊灯全通宵（20∶00至次日08∶00）诱捕法捕捉按蚊,次日清晨收集诱捕的蚊虫,经形态学鉴定蚊种,分析按蚊组成。收集饱血按蚊,分别提取单只蚊胃血的DNA,采用基于不同动物mtDNA-cytb序列差异的多重PCR法鉴定各蚊胃血源,计算人血指数,分析按蚊的吸血习性。结果共捕获按蚊1 442只,经形态学鉴定,多斑按蚊种团占99.6%（1 436/1 442）,带足按蚊和腹簇按蚊占0.4%（6/1442）。多斑按蚊种团中,伪威氏按蚊占85.5%（1228/1436）,威氏按蚊占14.5%（208/1 436）。用多重PCR检测202只多斑按蚊种团（伪威氏按蚊188只和威氏按蚊14只）的饱血蚊胃血,结果显示,伪威氏按蚊兼吸牛/猪血和人血,人血指数为0.35,威氏按蚊吸食猪血和人血,人血指数为0.29。结论西藏察隅县2种常见按蚊（伪威氏按蚊和威氏按蚊）均兼吸人畜血,伪威氏按蚊的人血指数较高。

中国对虾微卫星四重PCR技术的建立及其在模拟放流效果评估方面的应用

1引言 在中国对虾（Fenneropenaeus chinensis）选择育种过程中,需要建立家系进行育种参数评估。家系的混养有利于消除家系单独养殖情况下环境差异对遗传参数估计的影响,因此育种实践中常采用物理荧光标记实现家系的区分。但这种方法易对个体造成伤害,不易于大规模操作,且养殖过程中会有标记丢失现象，在一定程度上影响了育种参数的精确估算。

郑州市肠出血性大肠杆菌O157:H7感染监测

[目的]2005年监测郑州市肠出血性大肠杆菌O157:H7感染状况及病原分布特点,为各级卫生行政部门制订新发传染病防治措施,提供基础疫情资料。[方法]监测标本用免疫磁珠集菌方法(IMS)做病原学分离培养、毒力基因检测用多重PCR方法、药敏试验用(K-B)常规方法。[结果]腹泻病人标本185份,大肠杆菌O157:H7检出阳性4份。外环境标本588份,检出大肠杆菌O157:H7阳性20份。用多重PCR方法做毒力基因检测,有6份家畜家禽阳性标本中检出O157:H7毒力基因(Stx2、eaeA、HIyA)为阳性。药敏试验24株肠出血性大肠杆菌O157:H7对8种抗菌药物敏感率为95%以上,对新生霉素100%耐药,其余7种对抗菌药物敏感程度各有差异。[结论]郑州市有散在的大肠杆菌O157:H7感染的病人及动物疫点。奶牛和波尔山羊是大肠杆菌O157:H7动物宿主。

利用多重PCR反应同时筛选番茄Cf-9和Tm-1基因

利用同一PCR反应体系,对分别与番茄抗叶霉病的Cf-9基因和抗番茄烟草花叶病毒病的Tm-1基因紧密连锁的PCR标记进行了同时扩增筛选,扩增的特异性片段与单引物扩增片段吻合。其中与Cf-9基因紧密连锁的CAPs标记在抗感试材均可扩增出560bp的特异片段,且都存在TaqI酶切位点,抗病基因型酶切后分别产生了450bp、330bp和290bp的不同特异性片段,而感病基因型试材酶切后产生450bp和290bp的特异性片段;与Tm-1基因紧密连锁的SCAR标记为显性标记,只有抗病试材产生750bp的特异片段,不能被TaqI酶切。经反复验证,结果稳定准确,可用于在同一PCR反应体系中对两个抗病基因进行同时筛选鉴定。该体系的建立不仅省时、省工、节省费用,而且可用于苗期辅助选育,加快番茄抗病育种进程。

大白菜细胞质雄性不育的分子鉴定及序列分析

为了获得3种大白菜细胞质雄性不育系Ogu CMS,Pol CMS,CMS96和保持系间的多态性以及定位大白菜CMS96不育系所属的不育类型,利用设计的atp6,orf222单一和混合引物PCR扩增3组11份同核异质大白菜细胞质雄性不育系和保持系mtDNA。结果表明,atp6引物在大白菜Ogu CMS不育系扩增的200 bp片段为其特异带;orf222引物仅在大白菜Pol CMS和CMS96不育系有扩增产物,但二者有3点完全不同:大白菜Pol CMS不育系扩增产物为675bp,CMS96不育系扩增产物为669 bp,二者相差6个核苷酸,后者定名为大白菜CMS96-orf222。大白菜CMS96-orf222与甘蓝型油菜Nap CMS的nad5c基因和Nap-orf222基因同源性均为99%,E值为0.0;大白菜Pol CMS的675 bp序列具有ORF224开放阅读框,没有保守结构域,而大白菜CMS96的669 bp序列具有ORF222开放阅读框和保守结构域YMF19。另外,atp6和orf222混合引物多重PCR扩增产物存在明显多态性:800 bp为大白菜保持系的差异带型;2 300 bp和1 500 bp为大白菜Pol CMS不育系特异带型;200 bp为大白菜Ogu CMS不育系特异带型;690 bp为大白菜CMS96不育系特异带型。该方法仅用一次PCR反应快速地将3种大白菜细胞质雄性不育系和保持系一次性全部区分开,为大白菜分子育种和常规育种更好地相结合提供了简单、快速、准确和重复性好的方法和手段。

活动性肺结核患者α/βTCR基因重排及CDR3谱型分析

目的:建立多重PCR方法扩增α/βTCR全长序列,分析活动性肺结核患者病变局部T淋巴细胞α/βTCR基因重排特点及CDR3谱型。方法:分离结核患者肺泡灌洗液中的淋巴细胞,提取RNA后用SMART方法逆转录,运用根据现有文献设计的α和βTCR扩增引物,进行多重PCR扩增以获得其全长序列,构建重组质粒并测序,利用DNAstar及网上TCR资源分析序列。结果:3例患者共获得24个α链序列,13个β链序列。α链以AV1S2(54%)、AV12S3(41%)、AV12S2(5%)为主;β链以BV2(38%)、BV29S1(46%)、BV14(3%)、BV4S2(3%)为主。同一病例及不同病例之间CDR3区呈现多样性,但是标本1、标本3各有一条β链的CDR3氨基酸序列相同:SVGTGTLHQETQY;标本2和标本3的各有2条α链CDR3序列相同:AVRDWAGNMLT;标本2的一个α链和标本3的一个α链的CDR3均有:AV…DNN…RLM序列。结论:建立了TCRα和β链全长序列的多重PCR扩增方法。结核患者病变局部克隆性增殖的TCRα和β链谱型呈限制性取用,克隆增生的T淋巴细胞来自不同的亚群,但是相同的CDR3序列对于识别MTB多肽可能具有特异性。