辣椒小G蛋白CaROP的生物信息学分析

【目的】研究辣椒内小G蛋白CaROP的生物学功能、蛋白理化性质、蛋白结构及系统发育关系。【方法】运用ProtParam、ProtScale、SignalP5.0、TMHMM、NetPhos3.1和NetCGlyc1.0等生物信息学软件分析9个CaROP蛋白的蛋白理化特性;运用SOPMA和SWISS-MODEL等生物信息学软件预测分析9个CaROP蛋白的结构;运用生物信息学软件MEGA11分析9个CaROP蛋白的系统发育关系。【结果】9个CaROP蛋白的亲水性总平均值均小于0,均为亲水蛋白,其中6个为稳定的亲水蛋白;9个CaROP蛋白均无信号肽,即均为非分泌性蛋白;9个CaROP蛋白无跨膜结构域,即均非膜蛋白;9个CaROP蛋白均存在磷酸化位点,均无糖基化位点。9个CaROP蛋白的主要二级结构原件为无规则卷曲和α-螺旋,其次是β-折叠,最后是β-转角。9个CaROP蛋白聚为4个分支,其中分支Ⅰ和分支Ⅲ各包括1个CaROP蛋白。分支Ⅱ包括2个CaROP蛋白,其余5个CaROP蛋白均聚于分支Ⅳ中。【结论】9个CaROP蛋白具有完整的Rho功能域,均为非分泌性亲水蛋白。9个CaROP蛋白在系统进化树中共聚为了4个分支,其三级结构建模的预测结果也均较为理想,9个CaROP蛋白结构较稳定。

弓形虫MIC1、MIC6和ROP18混合蛋白对小鼠的免疫保护作用

为评估弓形虫微线体蛋白MIC1、MIC6和棒状体蛋白ROP18组成的重组疫苗对BALB/c小鼠的免疫保护作用,我们将重组表达的MIC1、MIC6和ROP18三种蛋白进行不同的组合,并联合弗氏佐剂通过皮下注射的方式免疫小鼠。用ELISA技术检测免疫后小鼠血清特异性抗体,以及免疫蛋白刺激后脾细胞培养上清中各细胞因子的水平,通过脾淋巴细胞增殖实验检测脾淋巴细胞增殖情况。最后一次免疫后,用弓形虫WH3强毒株攻击,观察并记录小鼠的存活情况。结果表明,与对照PBS组相比,蛋白免疫组产生高滴度的IgG和IgG亚型(IgG1和IgG2a)抗体,滴度可高达1∶128000。细胞因子IL-4、IL-10和IFN-γ表达水平不同程度地升高,并且重组蛋白能够诱导淋巴细胞特异性增殖。免疫组小鼠的生存时间较对照组有所延长,其中MIC6-ROP18组延长时间最长(P<0.01)。MIC1、MIC6和ROP18组成的重组疫苗能诱导小鼠产生较强的体液免疫和细胞免疫应答,其中MIC6-ROP18蛋白组合的免疫保护效果更为明显,但仍需进一步改进。本研究为弓形虫疫苗的研发提供了思路。

FOPS&ROPS翻滚试验台液压控制系统性能研究

为防止车辆侧翻和高空坠物对驾驶员造成伤害,矿山工程车辆普遍配备了FOPS&ROPS安全保护系统。这类车辆体积庞大、种类繁多,在优化改进FOPS&ROPS时多采用仿真技术,对其实际性能的检测需求也在不断增加。在中国,这类车辆必须经过有资质的检测机构对FOPS&ROPS进行检验并出具报告后才能投入使用。目前,国内外正积极开发FOPS&ROPS安全保护系统的试验平台,以进一步验证车辆的FOPS&ROPS性能是否符合标准规定,特别是当驾驶室变形时,DLV区域是否遭受侵犯。值得注意的是,国内搭建的ROPS试验台通常较为复杂,有的仍采用原始的油缸手动加载方式,这种方式载荷小且适用范围有限。因此,设计了一套基于FOPS试验台的ROPS液压控制系统,通过性能分析与试验验证来实现矿山工程车辆FOPS&ROPS的能力验证。结果表明:该ROPS液压控制系统能够满足矿山工程车辆ROPS安全保护系统性能验证分析的要求。

弓形虫ROP5与ROP18的双基因缺失株构建及表型鉴定

ROP5与ROP18都是弓形虫重要的毒力因子,本研究旨在构建弓形虫RH株ROP5单基因缺失株,在此基础上构建ROP5与ROP18的双基因缺失株,并研究ROP5基因、ROP18基因的表型功能,为探究两个基因的协同作用奠定基础。首先构建质粒pSAG1:CAS9::TgU6:sgROP5、pROP5::DHFR-D质粒,并将质粒电转至弓形虫RH株速殖子,经息疟定筛选及PCR鉴定;再将质粒pSAG1:CAS9::TgU6:sgROP18、pROP18::CAT-D电转至鉴定正确的ROP5单基因缺失株(ROP5-KO)速殖子中,经氯霉素筛选并进行PCR鉴定。结果显示:本试验成功获得ROP5-KO株及ROP5与ROP18的双基因缺失株(ROP5/ROP18-KO);两个基因同时缺失可明显降低弓形虫的入侵能力及生长速度;此外,双基因缺失后,弓形虫对小鼠的毒力明显减弱。本研究表明,同时敲除ROP5基因与ROP18基因后,弓形虫毒力显著降低,为进一步探究ROP5与ROP18的协同作用奠定了基础。

弓形虫棒状体蛋白ROP18表位肽抗体的制备与初步应用

设计并制备兔抗弓形虫棒状体蛋白ROP18的特异性表位肽抗体,并对其进行鉴定及初步应用。运用在线蛋白质分析软件Bepi Pred 1.0 Server预测和分析ROP18的抗原表位,人工合成选定的两段优势表位肽,与载体蛋白BSA偶联后分别免疫新西兰兔制备抗ROP18血清,通过ELISA鉴定其效价,Western blot鉴定其特异性,并将这两种抗体应用于免疫荧光和免疫共沉淀技术。间接ELISA结果显示两种抗体效价分别为1∶16 000、1∶64 000;Western blot结果显示,两种抗体均能够特异性识别弓形虫速殖子中的内源性天然ROP18蛋白和外源重组ROP18蛋白;免疫荧光检测到ROP18定位于弓形虫速殖子顶端及感染细胞的纳虫泡膜上;免疫共沉淀未能成功下拉目标蛋白。成功获得ROP18的两种表位肽多克隆抗体,效价高且特异性强,并成功应用于免疫荧光定位,为进一步探究ROP18在弓形虫中的功能和作用奠定了基础。

弓形虫ROP16蛋白对人乳腺癌MCF-7细胞增殖、周期和凋亡的影响

目的探讨弓形虫Ⅰ型(RH)ROP16蛋白在人乳腺癌MCF-7细胞增殖、周期及凋亡方面的作用。方法以空载体(MCF-7-HBLV)和过表达ROP16蛋白的慢病毒(HBLV-RH ROP16)分别感染MCF-7细胞,嘌呤霉素筛选出稳定表达ROP16的细胞株,Real time PCR、Western blot法检测MCF-7细胞中ROP16 mRNA和蛋白表达水平。CCK-8和流式细胞术检测细胞增殖、周期和凋亡。Western blot法检测细胞周期及凋亡相关蛋白表达。结果相比MCF-7-HBLV(空载体组)和MCF-7细胞组(对照组),MCF-7-RH ROP16细胞组中ROP16 mRNA和蛋白表达升高;细胞增殖率降低(P<0.01);S期细胞比例、细胞凋亡率升高(P<0.01)。促凋亡因子Bax、P53、Caspase-9、Caspase-3及细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子P21表达增高(P<0.01);抗凋亡蛋白Bcl-2及细胞周期蛋白A1(CyclinA1)、周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)的表达均下降(P<0.01)。结论弓形虫Ⅰ型(RH)ROP16蛋白可通过调节与凋亡、周期相关的细胞因子的表达,诱导MCF-7细胞凋亡,抑制其增殖并引起细胞周期阻滞。

一种体内检测ROP蛋白活性的方法及应用

【目的】建立一种体内检测ROP蛋白活性的方法,为进一步研究ROP蛋白的功能提供技术支持。【方法】该方法基于RIC作为ROP蛋白的效应子能特异地与活性形式的ROP结合这一特点,通过荧火素酶互补试验,借助烟草瞬时表达系统,利用植物活体成像仪和酶标仪进行定性或定量检测荧光强度,从而实现体内检测ROP蛋白的活性。【结果】以拟南芥AtRIC1为检测基因,以AtROP1为例来检测其蛋白活性,成功检测到了AtROP1与AtRIC1有荧光,表明它们有互作。同时对AtROP1蛋白进行了点突变试验,成功构建了持续激活态的ROP1(AtROP1-CA)和持续失活态的ROP1(AtROP1-DN)载体,通过定性定量检测,发现与AtROP1-DN相比,AtRIC1与AtROP1-CA有更强的荧光信号,表明AtRIC1可以作为检测蛋白来检测AtROP1蛋白的活性。此外,通过引入3个蛋白(以AtGAP1、AtGDI1和AtGEF1蛋白为例),利用该方法进一步检测,表明AtGAP1和AtGDI1作为AtROP1蛋白活性的抑制因子,明显降低了AtROP1蛋白的活性;而AtGEF1作为AtROP1蛋白活性的促进因子,明显提高了AtROP1蛋白的活性,说明该方法还可以通过At-RIC1检测其他蛋白对AtROP1蛋白活性的影响。同时,该方法还解决了之前单一的pull-down试验检测ROP蛋白活性变化的问题,增加了一种新的体内检测ROP蛋白活性的方法。【结论】与其他方法相比,该方法具有高灵敏度、可视化、可定量化和操作简单等特点,并且适用于检测其他蛋白对ROP蛋白活性的影响,所以该方法是一种可靠的体内检测ROP蛋白活性的新方法。

蔷薇科小G蛋白ROP的鉴定、分类及特征分析

为全面系统地挖掘蔷薇科小G蛋白ROP,在分子水平上为蔷薇科抗病育种提供候选基因。物种系统进化关系分析、ROP蛋白全基因组筛查、Rho功能域分析、蛋白聚类分析及理化性质分析分别运用了NCBI、iTOLv6、GDR、SMART、MEGA 11.0和Maximum-likelihood algorithm1及Protparam和Expasy等数据库及生物信息学在线软件。11种蔷薇科植物聚为6个亚支;11种蔷薇科植物中筛查到80个ROP蛋白;80个蔷薇科ROP蛋白和11个拟南芥ROP蛋白聚为6个进化分支;蛋白长度、等电点、分子量、脂肪指数及不稳定指数分别为143~215 aa、5.59~9.63、15.73599~23.87859 ku、85.28~94.95和27.96~57.14。80个蔷薇科ROP蛋白在草莓中数量最多,甜樱桃最少;蔷薇科ROP蛋白分布于第Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ分支中,拟南芥ROP蛋白分布于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ分支中,即分支Ⅵ为蔷薇科特异性分支,分支Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ为拟南芥特异性分支。

弓形虫TR与ROP18双基因缺失及对NF-κB-IL-12-ROS信号通路相关因子的影响

为探究弓形虫的TR与ROP18基因对NF-κB-IL-12-ROS信号通路的影响和抗宿主ROS损伤中是否具有协同作用,本研究利用CRISPR/Cas9技术构建了TR与ROP18双基因敲除株(TR-ROP18-KO)。通过检测TR/ROP18单、双基因缺失株氧化应激水平以及对小鼠巨噬细胞活性氧(ROS)水平影响的研究发现,TR-ROP18-KO株引发的氧化应激水平极显著高于RH株(P<0.01),但与TR单基因缺失株无显著差异(P>0.05);利用RT-PCR检测TR/ROP18单、双基因缺失株感染小鼠巨噬细胞产生的NF-κB、IL-12 mRNA水平和ELISA检测小鼠血清中IL-12的水平发现,TR-ROP18-KO株感染组虽然极显著高于RH株感染组(P<0.01),但TR-ROP18-KO株感染组却未显著高于TR-KO株感染组(P>0.05),表明弓形虫TR与ROP18基因在抗宿主ROS损伤中不存在协同作用。本研究利用TR与ROP18双基因缺失株能够明确解析这两个基因在抗宿主ROS损伤中有无协同作用,为深入研究这两个基因在I型弓形虫免疫逃避途径中的协同作用奠定基础,这也为后续弓形虫双基因功能协同作用的研究提供了一个新思路。

植物小G蛋白ROPs生物学功能研究进展

ROP(Rho-related GTPases from plants)是一类信号小G蛋白,为高等植物所特有,且分布广泛。近年来已引起社会的广泛关注,从各种植物中分离出的Rop数量也在逐渐增加。本研究分析了多年以来拟南芥、水稻、大麦、番茄、烟草、辣椒、马铃薯等植物中小G蛋白ROPs生物学功能研究进展,并对小G蛋白ROPs在生物学功能上的最新研究进行综述,为研究其他植物小G蛋白ROPs奠定基础,进而为其他植物ROP蛋白功能研究提供借鉴。

ROP信号途径在细胞极性发育中的研究进展

细胞极性生长机理研究主要围绕极性生长区域的建立和维持、胞内外信号对该区域的时空调控等核心问题而展开。目前已知多个信号分子,如钙离子、ROP小G蛋白和活性氧等在植物细胞极性发育中发挥重要作用,调控胞内细胞骨架的动态重组、囊泡的极性运输和胞吐作用等多方面。本文主要对植物特有的小G蛋白家族ROP在极性发育模式系统(花粉管、根毛与铺板细胞)中的相关研究进展进行了系统的归纳总结,并在此基础之上对可能的调控机制进行了初步的展望。

具有独立缓冲结构的PDC—牙轮复合钻头研制

油气勘探开发过程中,难钻地层钻井效率低、钻头寿命短是影响深井、超深井钻井周期和成本的瓶颈问题。钻头工作过程中切削结构轮流与井壁接触而产生的多边形效应是导致钻头不稳定工作、切削齿冲击失效的主要因素。为提高钻头工作稳定性,提出了具有独立缓冲结构的PDC—牙轮复合钻头新结构,并针对四川盆地茅口组Ø311.2 mm井段常规PDC钻头冲击失效严重的问题,设计了3+3+3型(3个主刀翼、3个牙轮以及3个独立缓冲刀翼)的独立缓冲结构复合钻头,开展了全尺寸钻头室内钻进对比实验,并在川渝页岩气区块茅口组—栖霞组地层进行了实钻应用。研究结果表明:①独立缓冲结构复合钻头在常规复合钻头的牙轮切削结构和固定切削结构之间的空隙部位增设独立缓冲刀翼,有效缓解了多边形效应,对PDC齿形成很好的缓冲保护,同时分担了过大的钻压,限制了切削齿吃入深度,进而防止了钻头产生粘滑振动;②独立缓冲结构复合钻头钻压和扭矩波动小,扭矩为PDC钻头的1/5;③独立缓冲结构复合钻头取得了单只钻头进尺170 m的记录,比邻井同层位单只PDC钻头最高进尺提高了73.5%。结论认为,独立缓冲刀翼对提高钻头的稳定性起到了关键作用,不仅提高了钻头寿命,而且有效提高了复杂难钻地层及复杂结构井的综合钻井时效,有效降低了油气勘探开发成本。

冲击破岩钻井提速技术研究现状与发展建议

提高钻井速度不仅是提高我国油气效益开发及深地勘探等方面的重要技术手段,同时对保障国家能源安全意义重大。冲击破岩钻井技术在国内外油田现场应用并获得了良好的提速效果,持续开展此类技术攻关有望攻克当下我国深地高温高压硬岩地层进尺低、提速难的技术痛点。介绍和分析了轴向冲击、扭力冲击和轴-扭耦合冲击辅助钻头破岩钻进技术方面的实践及发展动态。结合冲击破岩钻井技术现状,阐明了冲击辅助钻头破岩力学原理是冲击破岩钻井提速技术的关键问题,综述了国内外研究学者在冲击辅助钻头破岩物理实验、理论模型和数值模拟等研究方法上取得的科学进展。针对冲击破岩钻井提速技术的发展提出了相关建议,即加强在材料结构优化设计、智能化控制、多元技术融合和井场应用优化等方面的研究力度,为我国能源高效开发做出贡献。

山东农业大学揭示ROPs蛋白调控拟南芥花粉萌发的重要机制

2023年4月,山东农业大学生命科学学院张彦和李厦教授团队在《Plant Physiology》在线发表题为“RHO of plant proteins are essential for pollen germination in Arabidopsis”的研究论文,阐明了拟南芥BDR8及BDR9作为ROP的下游效应因子,在ROP调控花粉萌发过程中发挥关键作用。

四川盆地深层页岩气钻井关键技术新进展及发展展望

四川盆地页岩气资源丰富,目前深层页岩气已成为该盆地天然气增储上产的重点领域,但随着埋深增加和构造背景变化,地质工程条件将更加复杂,钻井过程中将面临井漏风险高、井下工具高温易失效、水平井轨迹控制难度大等技术难题。为此,在系统分析已完钻井实钻数据的基础上,依据深层页岩气区块地质工程特征,系统梳理了影响安全优快钻井的关键技术难点,形成了以地质工程一体化导向技术、钻井提速技术、防漏治漏与复杂防治技术为主体的深层页岩气安全优快钻井关键技术系列。研究结果表明:(1)以精细地质建模优选地质工程“双甜点”、实时靶体追踪为主的地质工程一体化导向技术,实现了地质目标的精准优选和精确追踪;(2)以“高效PDC钻头选型+个性化优化+大扭矩螺杆”高效破岩技术、“MSE+CCS”参数实时优化技术、油基钻井液地面降温+高温旋转导向技术为主的钻井提速技术,实现了页岩气钻井提速提效;(3)以井壁稳定性评价、裂缝性漏层识别、井漏与复杂防治为主的复杂防治技术,从源头降低了井下漏失和卡钻风险。结论认为:(1)形成的深层页岩气安全优快钻井技术,显著提高了机械钻速和铂金靶体钻遇率,在现场规模化推广应用200余口井,单井平均钻井周期降低42.7%,钻井提速效果显著,有力支撑了深层页岩气效益规模开发;(2)深层页岩气钻井将聚焦“地质工程一体化、水平段一趟钻、防漏治漏及智能钻井决策”等方面的技术攻关。

PDC钻头数字化选型技术及软件开发

钻井过程中产生大量与地层、钻头相关的工程数据,利用大数据分析技术优选钻头能用于指导钻头的选型、设计和使用,可使钻头的选用从依赖厂家和经验,转向依据科学的结构特征分析和大数据优选。通过开展PDC钻头结构特征数字化方法研究,建立基于统计数据分析的钻头结构特征推荐与选型技术,形成以数据提取与效能分析、钻头结构特征数字化,以及钻头结构特征重构选型3项内容为核心的基本步骤和分析策略,在此基础上建立了一套PDC钻头数字化选型技术和配套软件。较常规钻头进尺与钻速对比分析选型方法,该技术重点考虑了结构特征对钻头使用效能的影响,体现了实钻工程数据对钻头选型的指导作用。应用该技术与软件开展了准噶尔盆地某区块PDC钻头选型,并进行实钻验证。应用结果表明,选用的钻头钻进中钻速和进尺显著提升,缩短了钻井周期。研究技术与成果有利于提升钻井服务技术水平,可为油气田数字化、智能化发展奠定基础。

库车山前气体钻井技术应用效果评价

塔里木油田从2006年来在库车山前大北、博孜、迪北3个区块开展了气体钻井技术的探索与应用,取得了显著效果。其中,针对塔里木库车山前高陡巨厚砾岩层研磨性强、可钻相差、井壁稳定性差等,开展了空气钻井技术的探索、升级配套以及优化完善,有效解决了库车山前砾石核心区地层难钻的问题,大幅提高了钻井效率,新实施井平均机械钻速达到6.93 m/h,是同区钻井液钻进的两倍以上,钻井周期较设计缩短54.2%;针对迪北构造阿合组致密敏感性储层采用氮气钻完井技术,“零污染”钻进,扩大了勘探发现,提高了开发产能,DB104井日产气量高达72.6×104m3,日产油量51.36 m3,与同区块常规钻完井方式相比,大幅度提高了日产气量。但气体钻完井中仍然存在油钻杆完井管柱不能满足长效安全生产等问题,建议持续开展技术攻关,以保障氮气钻安全钻进和开发。通过文章的梳理,有助于塔里木油田气体钻井技术进一步发展,同时为国内其他区块的气体钻井技术升级提供借鉴。

自控型粒子冲击钻井系统研制与现场试验

我国油气资源勘探开发中常规钻井技术在钻遇石英砂岩、燧石、高硅质砂岩、黄铁矿和火成岩等难钻地层时,面临“钻速慢、进尺短”的钻井瓶颈。为此,基于粒子高频冲击破岩原理,借鉴高层建筑混凝土配浆-注浆和常压混凝土储存方法,设计了双活塞换向机构、防粒子沉淀物料罐、动态回收储存装置、高效分离装置和2D/3D自动化监控系统,研制了1套自控型粒子冲击钻井系统,并在江沙X1井对其进行了现场试验。试验结果表明:该系统运行稳定可靠,粒子回收率达到98.7%,平均机械钻速15 m/h,与邻井同地层螺杆配PDC钻头钻进方式相比平均机械钻速提高1.52倍。所得结论可为深层及复杂坚硬地层钻井提速提供技术支撑。

采后玉露桃果实冷害发生与ROP基因的表达调控

以软溶质玉露桃果实为材料,于8℃、5℃、0℃和LTC(8℃锻炼3d再转到0℃贮藏)下贮藏30d后转至货架(20℃)2d,对各个处理果实的腐烂和冷害程度、果实品质变化规律以及ROP基因的表达模式进行了比较,以探讨ROP基因与低温胁迫的关系。结果表明,经5℃和0℃贮藏30d的玉露桃果实在货架期间褐变加重,经5℃处理的果实褐变最重,经0℃处理果实表现后熟障碍;经8℃贮藏30d以及后续2d货架期的果实不出现冷害症状,但果实腐烂严重;LTC处理果实经冷藏后在货架期后熟正常,且果实冷害和腐烂均被明显抑制。各处理桃果实在采后低温贮藏过程中总可溶性糖和总有机酸质量分数均趋下降,其中5℃处理果实总可溶性糖质量分数下降幅度最大。结合应用EST检索和RT-PCR克隆扩增,分离出桃ROP基因(PpROP)。实时定量PCR结果显示,PpROP在5℃下表达迅速增强,第5天达到高峰,其丰度明显高于其他处理,LTC处理使PpROP表达维持较低水平。

蒺藜苜蓿小G蛋白MtROP9基因的克隆与表达分析

【目的】对蒺藜苜蓿ROP基因进行克隆与表达分析,为深入研究ROP基因在豆科植物与根瘤菌共生互作过程中的功能提供理论依据。【方法】依据拟南芥11个ROP保守序列特征和蒺藜苜蓿数据库信息,同源克隆蒺藜苜蓿的MtROP9基因,采用生物信息学方法对该基因序列进行分析,并采用半定量RT-PCR法,对MtROP9基因在蒺藜苜蓿不同组织及根瘤菌侵染后不同时间根系中的表达水平进行检测。【结果】从蒺藜苜蓿根系中克隆到了MtROP9基因的cDNA序列,全长为947 bp,编码209个氨基酸。序列分析表明,MtROP9具有ROP蛋白典型的结构特征,并与拟南芥AtROP9、水稻OsRac2、葡萄VvROP9、玉米ZmROP6和ZmROP7具有高度的相似性。MtROP9基因具有一定的时空表达特性,在根系和花中表达水平较高,在茎和根瘤中表达水平相对较低,在叶中几乎不表达。在蒺藜苜蓿与根瘤菌共生互作的早期,MtROP9基因能够被根瘤菌侵染诱导表达,在根瘤菌诱导处理不同时间的根系表达水平不同。【结论】克隆了蒺藜苜蓿小G蛋白MtROP9基因。MtROP9基因可能参与了豆科植物与根瘤菌共生互作早期信号的调控。