茵栀黄颗粒对雌激素诱导的胆汁瘀积大鼠肝细胞膜多药耐药相关转运体Mrp1~4的调节作用

目的考察茵栀黄颗粒对胆汁瘀积大鼠肝脏转运体多药耐药相关蛋白1~4（Mrp1~4）表达的影响。方法 Wistar雄性大鼠20只,随机分为4组,即正常组、模型组、对照组和茵栀黄组,每组5只。大鼠颈部皮下连续注射苯甲酸雌二醇[EB,5 mg/（kg·d）]造模。Western blot实验考察茵栀黄颗粒对肝脏转运体Mrp1~4的调节作用。结果与对照组相比,茵栀黄组肝细胞膜转运体Mrp1~3的表达均显著增加（P〈0.05）,而Mrp4的表达差异无统计学意义（P〉0.05）。结论茵栀黄颗粒能明显上调胆汁瘀积模型大鼠肝细胞膜转运体Mrp1~3的表达,但对Mrp4的表达无影响。

人MRP4蛋白结构与功能预测

多药耐药相关蛋白4(multidrug resistance-associated protein 4,MRP4)是一种能够利用ATP水解产生的能量转运多种物质的六重跨膜蛋白。本研究应用Expasy、Jpred4、UniProt-KB、NCBI等公共数据库和在线软件分析其理化性质、蛋白结构、结构域、亚细胞定位、互作蛋白以及功能等信息,为其在多种生理病理过程中的作用与机制研究奠定基础。MRP4蛋白含有1325个氨基酸,相对分子质量约为149526.77,理论等电点为8.41。以α-螺旋为主,占比58.42%。含有2个跨膜结构域和2个ATP结合盒以及8个保守结构域。表观遗传学修饰位点56个,其中磷酸化位点27个,泛素化位点27个,乙酰化位点2个。MRP4蛋白分布于质膜上,具有ATP酶和跨膜转运蛋白活性,参与内外源性物质运输、前列腺素分泌、纤毛组装、信号转导运输等生命过程。本研究系统性梳理并整合了MRP4蛋白结构及功能等信息,为深入研究其在机体生命活动及疾病发生中的作用与机制奠定理论依据。

NNK对BEP2D细胞耐药基因表达的影响

目的探讨4-甲基亚硝胺-1-3-呲啶基-1-丁酮(NNK)对BEP2D细胞多药耐药相关蛋白(MRP)、肺耐药相关蛋白(LRP)表达的影响。方法应用NNK 500μg/m l干预BEP2D细胞生长,收集连续干预后第10、20、30代NNK-500细胞,行接种裸鼠成瘤试验检验其成瘤性;采用RT-PCR检测BEP2D细胞,以及第10、20、30代NNK-500细胞的MRP、LRP表达量。结果经NNK干预后的第20、30代NNK-500细胞接种裸鼠成瘤,病理切片显示为高分化鳞癌;RT-PCR显示,在BEP2D细胞中MRP、LRP呈低度表达,第10、20代NNK-500细胞的表达量略有增加,第30代NNK-500细胞的表达量明显增加(P<0.01)。结论 NNK对BEP2D细胞有致癌性,可增加BEP2D细胞的MRP、LRP表达,降低化疗敏感性。

应用RNA干扰下调多药耐药蛋白4表达对结直肠癌细胞照射敏感性的影响

目的探讨多药耐药蛋白4（MRP4）表达对结直肠癌细胞照射敏感性的影响。方法应用慢病毒感染RNA干扰技术（RNAi）稳定下调人结直肠癌细胞株HCT116中MRP4的表达。将HCT116细胞分为未感染任何病毒的细胞株（CON）、加阴性对照病毒感染的细胞株（NC）和加RNAi靶点病毒感染的细胞株（KD）3组,应用实时定量RT-PCR和Western blot分别从RNA和蛋白水平检测MRP4表达变化,以验证RNAi的有效性。4Gy剂量照射后24h，流式细胞术检测细胞凋亡,MTT检测细胞增殖,比较RNAi后HCT116细胞株照射敏感性的差异。结果成功构建并转染慢病毒质粒,获得稳定沉默MRP4表达的HCT116-KD细胞株,HCT116-KD细胞株MRP4mRNA和蛋白表达水平较对照均明显下调（P〈0．05）。照射后24h，KD细胞株凋亡率为（71．7±0．8）％，明显高于CON组[（56．1±0．9）％]和NC组[（59．8±0．8）％]（P〈0．05）。照射后48h和72h，KD细胞增殖能力较对照组明显下降（火0．05）。结论MRP4在结直肠癌细胞中的表达水平与照射耐受显著相关，应用慢病毒感染RNA干扰下调MRP4表达可以增强结直肠癌细胞照射敏感性。MRP4有可能成为预测放疗敏感性的分子标志物。

高原缺氧对血脑屏障中ATP-结合盒转运蛋白表达的影响

目的研究高原缺氧对血脑屏障(BBB)中ATP-结合盒(ABC)转运蛋白表达的影响,并探讨影响其表达的机制。方法将Wistar大鼠分为1500 m组(兰州实地)、4010 m组(模拟,低压氧舱,缺氧3 d)、6000 m组(模拟,低压氧舱,缺氧3 d)、苯妥英钠+1500 m组(在1500 m组基础上给予50 mg·kg^(-1)苯妥英钠)、苯妥英钠+4010 m组(在4010 m组基础上给予50 mg·kg^(-1)苯妥英钠)、苯妥英钠+6000 m组(在6000 m组基础上给予50 mg·kg^(-1)苯妥英钠)和缺氧1 d组、缺氧2 d组、缺氧3 d组、缺氧4 d组(模拟海拔4010 m,低氧氧舱,分别缺氧1、2、3和4 d)。用蛋白质印迹法检测BBB组织蛋白的表达水平,用高效液相色谱联用质谱法检测脑脊液苯妥英钠的浓度。结果1500 m、4010 m、6000 m组的P-糖蛋白(P-gp)蛋白相对表达水平分别为1.00±0.04、1.84±0.02和2.10±0.05,多药耐药相关蛋白-4(MRP4)蛋白相对表达水平分别为1.00±0.05、2.77±0.08和4.42±0.03,苯妥英钠在脑脊液中的浓度为(864.78±348.32)、(1000.22±273.90)和(1214.17±314.09)ng·mL^(-1)。1500 m组、4010 m组上述指标和6000 m组相比较,在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。缺氧1 d组、缺氧2 d组、缺氧3 d组、缺氧4 d组P-gp蛋白相对表达水平分别为1.00±0.03、1.85±0.04、3.10±0.02和2.17±0.05,MRP4蛋白相对表达水平分别为1.00±0.05、1.79±0.10、1.60±0.08和1.31±0.06,缺氧1 d组、缺氧2 d组、缺氧3 d组上述指标和缺氧4 d组比较,在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论不同的高原缺氧环境对BBB中ABC族转运蛋白的表达产生不同的影响,并影响其底物药物在体内的药物浓度。

多药耐药相关蛋白4对脂多糖诱导的内皮细胞通透性及细胞骨架的影响

目的探讨多药耐药相关蛋白4（MRP4）对脂多糖（LPS）诱导的大鼠肺微血管内皮细胞（PMVECs）通透性及细胞骨架的影响。方法PMVECs细胞株培养3至6代后随机分为4组，对照组（细胞不做任何处理）、LPS组（细胞仅接受LPS刺激）、shMRP4重组腺病毒组（Ad—shMRP4，将针对大鼠MRP4基因设计的短发夹RNA构建腺病毒载体上，通过腺病毒感染细胞＋LPS刺激）、shRNA重组腺病毒组（Ad—shRNA，带绿色荧光蛋白基因空白的重组腺病毒载体感染细胞＋LPS刺激）。通过荧光显微镜观察细胞感染率，Western botting检测MRPg的表达水平，Transwell小室法检测单层细胞通透性，激光共聚焦显微镜观察细胞内纤维肌动蛋白（F—actin）形态及分布情况。多组间差异采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD—t检验，以P〈0．05为差异有统计学意义。结果与对照组比较，LPS组及Ad—shRNA组MRP4的表达水平显著上调（P〈0．05）、单层细胞通透性显著增加（2、6、12、24h分别为：0．28±0．02和0．41±0．04、0．32±0．02；0．30±0．01和0．53±0．04、0．39±0．03；0．33±0．04和1．12±0．17、0．70±0．07；0．32±0．03和0．79±0．02、0．57±0．05，P〈0．05），F-actin分布紊乱、重构以及应力纤维形成。与LPS组比较，Ad．shMRP4组MRP4的表达水平明显下调（P〈0．05）、单层细胞通透性明显降低（2、6、12、24h分别为：0．41±0．04和0．32±0．02；0．53±0.04和0．39±0．03；1．12±0．17和0．70±0.07；0．79±0．02和0．57±0．05，P〈0．05），F-actin重构以及应力纤维形成显著减少。结论MRP4基因沉默显著增减轻LPS诱导的内皮细胞通透性增高及细胞骨架破坏，对内皮细胞屏障发挥保护作用。

多药耐药相关蛋白4抑制剂对脓毒症急性肺损伤大鼠的保护作用

目的探讨多药耐药相关蛋白4（MRP4）抑制剂对脓毒症急性肺损伤（ALI）大鼠的保护作用。方法将60只雄性sD大鼠按随机数字表法分为假手术（Sham）组、脓毒症组及MRP4抑制剂MK571干预组，每组20只。采用盲肠结扎穿孔术（CLP）建立大鼠脓毒症模型，Sham组仅开腹不进行盲肠结扎和穿刺。MK571干预组于制模前30min腹腔注射20mg／kgMRP4抑制剂MK571，Sham组和脓毒症组给予等量生理盐水。于术后24h取大鼠股动脉血进行血气分析，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平；取肺组织计算湿／干质量（W／D）比值，采用蛋白质免疫印迹试验（WesternBlot）检测MRP4蛋白表达。结果与Sham组相比，脓毒症大鼠动脉血pH值和动脉血氧分压（PaO：）显著降低[pH值：7．18±0．03比7．40±0．03，PaO，（mmHg，1mmHg=0．133kPa）：63．15±6．24比98．05±2．58]，而动脉血二氧化碳分压（PaCO：）明显升高（mmHg：56．60±8．30比37．85±3．18），血清TNF-α水平亦显著升高（ng／L：146．24±19．99比25．77±9．83）；肺组织W／D比值明显增加（7．75±0．47比4．09±0．58），MRP4蛋白表达显著上调（灰度值：0．153±0．006比0．087±0．005，均（P〈0．05）。与脓毒症组相比，MK571预处理后大鼠动脉血pH值（7．30±0．02比7．18±0．03）和PaO2水平（mmHg：80．30±5．34比63．15±6．24）显著升高，PaC02明显降低（mmHg：29．25±3．24比56．60±8．30），血清TNF-α水平显著降低（ng／L：97．96±16．72比146．24±19．99）；肺组织W／D比值明显减少（5．89±0．51比7．75±0．47），MRP4蛋白表达显著下调（灰度值：0．124±0．006比0．153±0．006，均P〈0．05）。结论MRP4抑制剂通过下调MRP4表达可明显改善脓毒症AI大鼠肺功能，降低炎性因子水平，从而对ALl大鼠起到保护作用。

胆汁淤积下FGF19-ERK通路可上调MRP3/4表达减轻肝细胞损伤

该文采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)、蛋白印迹实验(Western blot)检测成纤维细胞因子19(fibroblast growth factor 19, FGF19)处理肝细胞癌细胞系HepG2后细胞自分泌的FGF19;具有胆汁酸排泌作用的多药耐药性蛋白3(multidrug resistance-associated protein 3, MRP3)和多药耐药性蛋白4(multidrug resistance-associated protein 4, MRP4)表达量的改变对胆汁淤积条件下肝细胞的保护作用。结果表明,使用FGF19处理HepG2细胞, MRP3、MRP4的mRNA和蛋白表达水平均显著上调并呈浓度和时间依赖性。Western blot进一步证实FGF19处理细胞可激活磷酸化细胞外信号调节激酶(extracellular signal related kinase, ERK)信号通路;使用ERK信号通路的特异性小分子抑制剂(PD98059)预处理HepG2再加入100 ng/mL的FGF19刺激细胞,与未加入PD98059的对照组相比, MRP3、MRP4的mRNA水平和蛋白水平均被抑制。综上所述, FGF19通过调控ERK信号通路特异性地上调MRP3和MRP4表达水平,在胆汁淤积条件下可增加胆汁酸排泌以保护肝细胞。

耐多药肺结核外周血Treg细胞表面CTLA-4、PD-1和ICOS表达及意义

目的探究耐多药肺结核(MDR-TB)患者外周血调节性T细胞(Treg)表面细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)、程序性死亡因子-1(PD-1)和可诱导共刺激分子(ICOS)的表达水平及临床意义。方法回顾性分析2016年6月-2020年6月海南医学院附属第二医院收治的763例MDR-TB患者(MDR-TB组)、531例非耐药肺结核患者(DS-TB组)和450名健康体检者(对照组)的临床资料,比较三组、MDR-TB组中不同预后患者外周血Treg细胞含量和Treg细胞表面CTLA-4、PD-1、ICOS的表达水平。结果MDR-TB组和DS-TB组γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素(IL)-4、IL-5水平均低于对照组(P<0.05);三组IL-10、IL-17、外周血Treg细胞含量和CTLA-4、PD-1表达水平比较,MDR-TB组>DS-TB组>对照组(P<0.05);MDR-TB组和DS-TB组ICOS表达水平高于对照组(P<0.05)。MDR-TB患者中,死亡组CTLA-4、PD-1和ICOS表达水平均高于生存组(P<0.05)。受试者工作特征(ROC)曲线分析结果显示,外周血Treg细胞表面CTLA-4、PD-1和ICOS诊断MDR-TB的曲线下面积(AUC)分别为0.859、0.733和0.616,CTLA-4、PD-1水平在诊断MDR-TB方面均有统计学意义(P<0.05),ICOS水平在诊断MDR-TB方面无统计学差异;预测MDR-TB患者预后的AUC值分别为0.719、0.780和0.795,均有统计学意义(P<0.05)。结论MDR-TB存在较为严重的免疫抑制,外周血Treg细胞表面CTLA-4、PD-1和ICOS可能参与MDR-TB的发生发展,三者对于MDR-TB的诊断及患者的预后具有一定预测价值。

他莫昔芬药物基因组学研究进展

他莫昔芬(tamoxifen,TAM)作为最常用的非甾体类抗雌激素药物,广泛用于雌激素受体/孕激素受体阳性的乳腺癌患者的辅助治疗。TAM主要通过肝脏的细胞色素P450酶代谢为活性产物4-羟基他莫昔芬(4-OHTAM)和N-去甲基-4-羟基-他莫昔芬(EDF),从而发挥药理作用。4-OH-TAM和EDF与受体结合的能力比TAM高30至100倍,从而能够有效的抑制雌激素受体依赖的乳腺癌细胞的细胞周期。CYP3A4和CYP2D6作为TAM主要代谢酶参与其代谢形成活性代谢物,这两种细胞色素酶都具有等位基因多的特点。CYP3A4和CYP2D6的基因多态性会影响TAM在患者体内的活性代谢物的血药浓度,从而可能会影响其治疗效果。参与TAM体内过程的主要转运体的基因多态性也会影响TAM在患者体内的血药浓度,进而影响接受TAM治疗的乳腺癌患者的临床预后效果。本文总结了TAM体内过程相关的代谢酶及转运体等的基因多态性与TAM活性代谢物浓度/疗效/不良反应的相关性,为进一步的药物基因组学研究以及临床合理用药提供参考。

SDF-1α/CXCR7介导结肠癌细胞对5-FU的耐药作用

目的:探讨间质细胞衍生因子1α(stromal cell-derived factor-1α,SDF-1α)通过其CXC结构趋化因子受体4(CXC-domain chemokine receptor 4,CXCR4)和CXCR7介导结肠癌细胞对5-氟尿嘧啶(5-uorouracil,5-FU)的耐药性及其可能的作用机制。方法:应用蛋白质印迹法检测结肠癌SW480、SW620、HCT116和HT29细胞中CXCR4和CXCR7的表达水平。分别用SDF-1α、SDF-1α+AMD3100(CXCR4抑制剂)或SDF-1α+抗CXCR7单克隆抗体处理SW480和HT29细胞6 h,再分别用3.1、6.25、12.5、25、50、100和150μg/mL 5-FU处理48 h后,应用磺酰罗丹明B(sulforhodamine B,SRB)染色法检测5-FU对各组细胞的半数抑制浓度(half inhibitory concentration,IC50)值,应用蛋白质印迹法检测各组结肠癌细胞中耐药相关蛋白P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)和多药耐药蛋白1(multidrug resistance protein-1,MRP-1)的表达情况。结果:结肠癌SW480和HT29细胞中CXCR4和CXCR7蛋白的表达水平高于SW620和HCT116细胞(P值均<0.05)。对于SW480和HT29细胞,SDF-1α处理组5-FU的IC50值高于未处理的对照组(P值均<0.05),SDF-1α+抗CXCR7单克隆抗体处理组5-FU的IC50值低于SDF-1α处理组(P值均<0.01),SDF-1α+AMD3100处理组5-FU的IC50值与SDF-1α处理组间的差异无统计学意义(P值均>0.05)。SW480和HT29细胞中,SDF-1α+抗CXCR7单克隆抗体处理组P-gp蛋白的表达水平均低于SDF-1α处理组(P值均<0.05),SDF-1α+AMD3100处理组P-gp蛋白的表达水平与SDF-1α处理组间的差异均无统计学意义(P值均>0.05);各组细胞中,MRP-1的表达水平间差异均无统计学意义(P值均>0.05)。结论:SDF-1α可促进结肠癌细胞对5-FU产生耐药性,这可能与SDF-1α/CXCR7信号通路上调P-gp的表达水平有关。