多子小瓜虫PCR和SYBR Green实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为克服现有小瓜虫病的显微镜检和PCR诊断等方法在该寄生虫的感染早期阶段和环境样本检测中存在的缺陷,建立特异性强、灵敏度高的多子小瓜虫PCR检测方法,实验根据多子小瓜虫线粒体COⅠ序列设计和筛选了一对引物,经过PCR程序优化、特异性、灵敏性验证以及临床和环境样品检测分析,分别建立了普通PCR和荧光定量PCR检测方法。结果显示,本研究获得的检测引物对多子小瓜虫有较高的扩增特异性,对同属纤毛虫类的草履虫、四膜虫和肠袋虫以及常见养殖鱼类宿主异育银鲫、草鱼、尼罗罗非鱼和团头鲂等样本均无扩增;扩增特异性和灵敏度都优于文献报道的方法。其中,普通PCR最低检测的样本浓度为掠食体2.67个/μL,荧光定量PCR在掠食体0.02个/μL时依然能有效检出,荧光定量PCR检测灵敏度高于普通PCR。研究表明,在临床样本和养殖水环境样本检测应用中,基于该引物的两种PCR方法表现出很高的一致性,能有效检出潜伏感染鱼体和养殖水环境中的多子小瓜虫。本研究所建立的多子小瓜虫的检测方法特异性强、灵敏度高,适用于淡水养殖中小瓜虫病的早期诊断和病原体的检测。

20种中草药杀灭离体小瓜虫的药效研究

选用20种不同中草药,研究其不同浓度的水提物对多子小瓜虫(Ichthyophthirius multifiliis)成虫、包囊和幼虫的离体杀灭实验效果。结果显示:0.1 g/L槟榔和乌梅对各个阶段的虫体均有杀灭效果,0.1 g/L大黄和黄芩1 h内对幼虫有杀灭效果,1.0 g/L浓度能杀灭成虫和包囊,表明槟榔、乌梅、大黄、黄芩的杀虫效果相对较好;贯众、乌药、枳壳等13种中药浓度达到10 g/L、50 g/L或100 g/L才具有一定杀虫作用,但效果不很显著;熟地黄、茯苓和黄芪即使浓度达到100 g/L时,也不能杀灭虫体。

长吻鮠幼鱼小瓜虫病的组织学观察

多子小瓜虫 (Ichthyophthiriusmultifiliis)主要寄生于鱼类皮肤、鳍、颌须、颏须和鳃 ,在长吻幼鱼的肌肉组织边缘发现有多子小瓜虫幼虫寄生 .感染部位均有上皮和结缔组织增生 ,形成白色囊泡 .皮肤和触须上的一些寄生部位糜烂、充血、色素层部分缺失 ,鳍条被挤压变形 ,严重感染者鳍、颌须和颏颏有不同程度的缺失 .讨论了该病造成长吻幼鱼致死率高和难治疗的原因以及可能的防治措施 .

重组多子小瓜虫抑动抗原ISCOMs制备

提取表达于四膜虫（Tetrahymena thermophila）细胞膜表面的多子小瓜虫抑动抗原。通过Western Blotting证实重组多子小瓜虫抑动抗原约为35.7 kD,其免疫原性与多子小瓜虫抑动抗原相似。以Quil-A作为佐剂,采用离心、超声波和透析等方法制备小瓜虫抑动抗原免疫刺激复合物（Iag-ISCOMs）。电镜观察可见Iag-ISCOMs经磷钨酸负染后呈直径30~40 nm的笼格状结构。免疫和攻毒试验证实Iag-ISCOMs对鳗鲡具有一定保护能力,攻毒后存活率达71.4%,对照组存活率为43.9%,结果表明,本实验成功制备了具有一定免疫原性的Iag-ISCOMs。

多子小瓜虫的形态发生及其寄生导致翘嘴鲌鳃组织病理变化

为阐明小瓜虫的形态发生及其对鳃组织的危害过程,本文开展了多子小瓜虫的光镜观察和翘嘴鲌鳃组织病理切片方面的研究。光镜形态研究发现小瓜虫运动时呈球形,直径500—800μm;前端具有耳廓状胞口和内陷的袋状胞咽;环境温度为18℃时,滋养体经1h左右发育成包囊,体表形成一层透明胶膜,并以虫体中央的分裂沟为界进行二分裂;子代虫体从8细胞期进入16细胞期时,包囊内部形成内胞膜将子代虫体等分为两个集团。组织切片结果显示虫体呈卵圆形,挤压了周围的包裹细胞,导致组织变形;鳃小片黏连,鳃丝上皮细胞受到破坏,严重区域鳃丝结构被完全破坏。本研究解析了小瓜虫的形态发生与发育过程以及对宿主危害的组织病理结构与机制,为揭示小瓜虫的侵染、发育和成熟规律奠定了理论基础,并为小瓜虫病害的有效防控提供理论资料。

小瓜虫病发生与越冬池水质、底质关系的探讨

1989年4月,作者对永吉县口前鱼种场发生小瓜虫病的越冬池的水质、底质进行了测定,结果表明,小瓜虫病的发生与水和底泥中的生态因子密切相关,环境不良将使小瓜虫病的病情加剧,鱼类死亡率大大提高。文中对小瓜虫病发生和防治等进行了讨论。

水温对多子小瓜虫孵化及幼虫活力的影响

多子小瓜虫引起的白点病是严重危害淡水鱼类的重要疾病之一，该寄生虫的发育繁殖受温度影响极大，因此，温度是影响小瓜虫培养及其疾病发生的重要因素。为了阐明温度在多子小瓜虫生活史中的作用，在实验条件下，研究了水温对该寄生虫包囊形成、孵化和幼虫活力的影响。结果表明：水温在4℃左右或28—32℃，多子小瓜虫都不能孵化，但有少部分虫体以包囊形式存活下来；在9～27℃，随水温升高，包囊形成和孵化时间缩短，孵化率升高至100％，孵出的感染性幼虫活力增强，但活力维持时间缩短至4h。因此，建议在多子小瓜虫培养及人工感染试验中，维持23℃左右的水温较合适，这时感染性幼虫使用的有效时限是孵出后4h内。

四氢异喹啉衍生物的合成及体外抗多子小瓜虫活性的研究

合成四氢异喹啉衍生物并进行杀多子小瓜虫(Ichthyophthirius multifiliis)药效评价。以1-甲基-1,2,3,4-四氢异喹啉为起始原料,在2位的胺基上引入与环己甲酰氯、苯甲酰氯、噻吩甲酰氯、乙酰氯以及氯乙酰氯等不同的酰基进而合成5种四氢异喹啉衍生物(化合物1~化合物5),研究其对小瓜虫掠食体和包囊的杀虫活性,并对杀虫活性物质进行安全性评价。结果显示,5种化合物均具有一定的杀虫活性,其中,化合物1 [(1-甲基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)-苯基-甲酮]的杀虫活性最强,其对多子小瓜虫掠食体4 h的100%杀灭浓度为24.0 mg/L,对包囊6 h的100%杀灭浓度为60.0 mg/L,对掠食体的半数致死浓度(LD_(50))为16.4mg/L。急性毒性实验结果显示,化合物1对翘嘴红鲌(Erythroculter ilishaeformi)的48 h LD_(50)为234.3 mg/L,其安全浓度为64.1 mg/L。研究表明,化合物1[(1-甲基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)-苯基-甲酮]是一种具有较好开发前景的杀小瓜虫药物。

简并PCR扩增小瓜虫抑动抗原基因的ORF

抑动蛋白是小瓜虫(Ichthyophthiriusmultifiliis)体表纤毛的主要构成部分,也是宿主免疫系统发挥抗虫免疫时的主要识别抗原。根据已经报道的3种抑动蛋白N端及C端保守的多肽片断,设计了一对简并引物P6/P7,以小瓜虫分离株IchFJ9的基因组为模板,成功扩增了抑动蛋白编码区(ORF)的全长基因序列。扩增的iagFJ9基因全长1398bp,编码466个氨基酸,包含18个非标准密码子TAA(Glu,Q)推导的氨基酸序列包含6个以CPXGT为起始的串联重复单位,具有抑动蛋白的特征性结构。同源比较分析显示,扩增的iagFJ9基因与已知的小瓜虫抑动蛋白基因IAG52A基因具有88%同源率。证实了iagFJ9是一个新发现的抑动蛋白基因,用简并PCR技术去发现小瓜虫抑动蛋白基因家族新基因是可行的。

多子小瓜虫感染后草鱼TLR信号通路基因的表达动态

【目的】明确草鱼Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)信号通路基因在防御多子小瓜虫(Ichthyophthiriusmultifiliis)感染过程中的免疫作用,为有效防控鱼类多子小瓜虫感染提供理论参考。【方法】以多子小瓜虫感染草鱼后,采用实时荧光定量PCR检测分析在不同时间点(感染后6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、5 d和7 d)草鱼部分TLRs基因(TLR1、TLR2、TLR4、TLR9、TLR20和TLR21)、接头蛋白基因(MyD88和TRIF)、信号转导分子(IRAK4和IRAK1)及细胞因子(IL-1β、TNF-α和IFN)在其皮肤和脾脏中的表达动态变化。【结果】草鱼感染多子小瓜虫后,TLR1、TLR2、TLR9、TLR20和TLR21基因在皮肤和脾脏中的表达主要呈上调趋势,TLR4基因在皮肤中主要呈上调表达,在脾脏中则主要呈下调表达;TLR信号通路接头蛋白基因MyD88和TRIF的表达变化趋势明显不同,其中,MyD88基因的表达在感染后第1~3 d均呈显著上调趋势(P<0.05,下同),而TRIF基因的表达在整个试验过程中绝大多数时间点与对照组无显著差异(P>0.05);IRAK4和IRAK1在皮肤和脾脏中的表达也主要呈上调趋势,但在脾脏中IRAK4在感染后第1 d和IRAK1在感染后第6 h的表达呈显著下调趋势;IL-1β和TNF-α在绝大多数时间点均显著上调,但IFN的表达基本没有变化。【结论】草鱼TLR信号通路中的部分TLRs基因(TL1、TLR2、TLR4、TLR9、TLR20和TLR21)、接头蛋白基因(MyD88)、信号转导分子(IRAK4和IRAK1)及下游细胞因子(IL-1β和TNF-α)均参与防御多子小瓜虫感染的免疫反应,尤其是在感染早期和中期发挥关键作用。

过氧乙酸对小瓜虫幼虫和包囊的杀灭效果

采用过氧乙酸对4种主要养殖鱼类进行急性毒性试验,测试了过氧乙酸对小瓜虫幼虫和不同发育阶段包囊的杀灭效果。结果显示:过氧乙酸对斑点叉尾鲴、草鱼、奥尼罗非鱼,鲫鱼的安全浓度依次为1.73、3.00、3.57、5.20 mg/L。过氧乙酸在浓度为6.250 mg/L时,0.5 h即能杀死全部小瓜虫幼虫;在1.562 mg/L时,1 h即能杀死全部幼虫。过氧乙酸对不同发育阶段的包囊都具有一定的杀灭效果,当过氧乙酸的浓度为6.250、3.125、1.562 mg/L时,刚脱落的包囊的死亡率依次为75.63%、45.60%、25.60%,脱落2h的包囊的死亡率分别为64.23%、46.32%、20.20%,脱落10 h的包囊的死亡率分别为65.86%、35.07%、10.20%。因此,过氧乙酸在较低的浓度范围内对小瓜虫的幼虫和包囊具有一定的杀灭效果。

链霉菌-XY52代谢产物对小瓜虫的体外杀灭活性研究

[目的]研究链霉菌发酵代谢产物对小瓜虫幼虫和包囊的杀灭活性。[方法]通过不同极性溶剂回流提取链霉菌发酵液,制备粗提物,进行杀灭小瓜虫幼虫和包囊的药效活性试验,并对活性部位进行安全性评价。[结果]链霉菌发酵液的乙酸乙酯和正丁醇提取物体外杀幼虫效果明显高于其他组别,其对小瓜虫幼虫的半数致死浓度分别为48.2和15.5 mg/L,正丁醇提取物浓度为30.0 mg/L时对小瓜虫包囊杀灭率为100%。急性毒性试验结果表明,正丁醇提取物对草鱼的48 h半致死浓度为(LC50)为195.0 mg/L,其安全浓度为48.7 mg/L。[结论]链霉菌-XY52代谢产物有望开发为一种比较安全的杀虫候选药物。

纤毛虫诱导鱼类免疫反应的研究

本文综述了纤毛虫诱导鱼类发生免疫反应的类型、免疫反应机制以及纤毛虫疫苗的研究现状。鱼类对纤毛虫诱导产生免疫反应的研究多集中在小瓜虫诱导鱼类免疫反应的研究。鱼类对小瓜虫免疫保护机制已基本弄清且已成功研制出小瓜虫疫苗,这是目前唯一的应用于实验室的寄生原生动物疫苗。

N-取代四氢异喹啉衍生物的合成及杀多子小瓜虫研究

以苯乙醇为起始原料,对醇基的α位碳上的氢进行取代,反应合成3种N-取代四氢异喹啉衍生物(化合物1~3),研究其对多子小瓜虫掠食体和包囊的杀虫活性,评价杀虫活性物质的安全性。试验结果表明,合成的3种四氢异喹啉衍生物对多子小瓜虫的掠食体和包囊均具有一定的杀灭作用,其中化合物1(2-甲胺基-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲腈)的杀虫活性最强,其对多子小瓜虫掠食体4h的100%灭杀质量浓度为20.0mg/L,对包囊6h的100%灭杀质量浓度为40.0mg/L,对掠食体的半数致死质量浓度为11.6mg/L。急性毒性试验结果显示,化合物1对翘嘴红鲌的48h半致死质量浓度为62.78mg/L。2-甲胺基-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲腈具有较好的体外杀多子小瓜虫活性,且毒性较低,具有较好的开发潜力。

小瓜虫对草鱼肝脏和肾脏等组织器官线粒体的影响

本试验旨在了解小瓜虫(Ichthyophthirius multifiliis)感染草鱼后对草鱼肝脏、肾脏和肌肉等组织器官线粒体的影响。人工方法用小瓜虫感染健康草鱼,确定草鱼成功感染小瓜虫后,透射电镜观察肝脏、肾脏和肌肉组织中线粒体结构的变化,检测这些组织器官的过氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)含量。透射电镜观察结果显示,与正常组相比,感染组肾脏、肝脏和肌肉组织线粒体数量减少,线粒体肿胀、嵴断裂或消失。感染组肝脏、肾脏和肌肉组织中SOD含量平均值均高于正常组,其中肝脏、肾脏表现为差异显著(P<0.05),肌肉组织差异不显著(P>0.05);感染组肝脏、肾脏和肌肉组织中MDA平均含量均低于正常组,其中肝脏、肾脏表现为差异显著(P<0.05),肌肉组织差异不显著(P>0.05)。结果表明,小瓜虫感染草鱼后,对草鱼的肝脏、肾脏和肌肉组织的线粒体结构及SOD和MDA活性均有影响。

40种中草药杀灭离体多子小瓜虫效果研究

研究了40种中草药不同浓度水提物对多子小瓜虫(Ichthyophthirius multifiliis)的离体杀灭效果,结果表明:夏枯草、仙鹤草和三七等18种中草药在浓度为50g/L时才能在4h内杀灭多子小瓜虫滋养体;药物浓度为10g/L时,槐花、皂角刺和毛冬青等13种中草药可杀灭滋养体;药物浓度为1g/L时,紫荆和鹅不食草即可杀灭滋养体;药物浓度为0.1g/L时,只有生姜能杀灭多子小瓜虫滋养体。生姜水提物对滋养体和幼虫的最低致死浓度分别为100、50mg/L,半数有效浓度分别为30.3、15.7mg/L,100mg/L可完全抑制包囊孵化。由此可见生姜是一种可有效杀灭多子小瓜虫的中草药。

岩原鲤稚鱼期小瓜虫病急性感染与治疗

水温25-26℃时,小瓜虫造成岩原鲤稚鱼严重感染,并引起大量死亡。经福尔马林液浸浴、升温处理和综合疗法, 结果发现:岩厚鲤对福尔马林非常敏感,不能用于其患病稚鱼的治疗;在适温范围内,升温处理是一种安全有效的方法,并筛选出33℃-34℃效果最好;综合疗法对岩原鲤稚鱼早期小瓜虫病的防治是另一种切实可行的特殊方法。

刺激隐核虫与多子小瓜虫免疫学特性比较研究综述

刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)与多子小瓜虫(Ichthyophthirius multifiliis)是影响渔业生产重要寄生虫,本文主要阐述了刺激隐核虫与多子小瓜虫种内和种间的免疫学相似性和差异性,及其两种寄生虫抑动抗原的免疫学特性以及克隆表达研究。为免疫学方法预防两种寄生虫病提供理论依据。

溶氧对斑点叉尾鮰免疫机能及抗病力的影响

[目的]研究溶氧水平对斑点叉尾鮰免疫机能及抗病力的影响。[方法]设置4个溶氧水平:(2.01±0.26)、(4.17±0.53)、(6.32±0.59)、(8.86±1.01)mg/L,分别记作A、B、C、D组,饲养斑点叉尾鮰,于饲养试验开始后的0、7、14、28、56d取样观察外周血白细胞数(WBC)、白细胞吞噬百分比(PP)和吞噬指数(PI)、溶菌酶活力、补体C3和C4水平、皮质醇及血糖水平,并观察小瓜虫感染后上述指标的变化及累计死亡率。[结果]饲养试验最后,WBC、PP、PI均以A组最低;饲养试验期间,A组溶菌酶活力、皮质醇水平和血糖水平先升后降,补体C3、C4含量显著降低;除血糖外,各组所有指标均在感染前期升高,后期显著降低;A组免疫指标在感染后期最低,同时累计死亡率最高。[结论]慢性低氧胁迫降低了斑点叉尾鮰的免疫机能及对小瓜虫的抗病力。

重组小瓜虫抑动抗原表达产物的纯化及其免疫学特性分析

培养表达小瓜虫抑动抗原的重组四膜虫(Tetrahymena thermophila)G1株,诱导表达小瓜虫的抑动抗原,采用非离子型去污剂Triton X-114提取虫体膜蛋白,然后通过亲和层析法纯化抑动抗原。采用ELISA、SDS-PAGE和Western Blotting分析所提取的抑动抗原的纯度及免疫学特性。结果表明:通过亲和层析能够得到重组四膜虫所表达的G1抑动抗原蛋白,它与相应血清型小瓜虫抑动抗原的分子量和免疫原性相近,其分子量为44 kDa(还原条件)或36 kDa(非还原条件)。