猕猴桃溃疡病病原菌MLVA分型引物的筛选及验证

【目的】筛选出一组可精准快速地对丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.actinidiae,Psa)进行分型的引物组合。【方法】针对前期文献已报道的34对引物,采用PCR技术验证该34对引物对中国Psa菌株的扩增效率及准确性;利用模拟PCR获取菌株串联重复(TR)数;以辛普森指数(Simpson’s index,SI)作为筛选引物组合的标准,基于R软件平台,筛选最优引物组合。【结果】34对引物对中国Psa扩增效果均良好,其中TR14与TR11II、TR19与Psa-01引物序列相同;TR8与Psa-08、TR39II与Psa-10、GM-1834与TR10I、GM-1553与TR64II、TR19Psa-01与TR19II扩增同一TR;Psa-09扩增产物串联重复单元长度不唯一,TR2II扩增产物侧翼变异较大,不能通过电泳确定串联重复数;最终确定SI值与全部引物组合相同的最低引物数量为9对,使用该9对引物的组合可将Psa已知的5种生物型准确分开。【结论】TR23/Psa-04、Psa-03、Psa-05、Psa-06、TR10IGM-1834、TR30I、TR1II、Psa-10TR39II、TR64IIGM-1553等9对引物可代表当前文献报道的34对引物,进行Psa分型研究,探索猕猴桃溃疡病的传播和流行规律,为病害防控策略的制定提供科学依据。

CNV结合STR分型技术检测孕早期流产组织潜在葡萄胎效果及风险因素分析

目的:评估基因组拷贝数变异测序(CNV-seq)结合短串联重复序列(STR)多态性分析技术在检测孕早期(≤9周)流产物组织中潜在葡萄胎病例的应用效果.方法:收集2021年1月-2022年12月行孕早期流产组织CNV-seq结合STR多态性检测病例114例,其中部分新鲜绒毛组织进行CNV-seq结合STR多态性检测,部分组织行病理学检测.比较两种检测方法结果,并分析潜在葡萄胎病例的临床特征和影响因素.结果:CNV-seq结合STR多态性检测共检出染色体异常病例28例,阳性率为24.6%,其中单亲二倍体(UPD)8例,占阳性病例28.6%;病理学检出葡萄胎病例12例,阳性率为10.5%,其中完全性葡萄胎(CHM)10例,占阳性病例的83.3%.两种检测方法的结果一致率为89.5%,Kappa值为0.75,两种方法具较好一致性.潜在葡萄胎病例与非葡萄胎病例在年龄、孕次、流产次、β-hCG水平、超声表现等方面有差异,其中年龄、β-hCG水平和超声表现是潜在葡萄胎危险因素(均P<0.05).结论:CNV-seq结合STR多态性分析技术能有效检测孕早期流产物组织中潜在葡萄胎病例,有助于指导临床治疗和避免再次流产.

71株浙江省结核分枝杆菌临床分离株MLVA基因分型研究

目的初步探讨浙江省结核分枝杆菌的数目可变串联重复序列(VNTR)的分型及分布特征。方法随机选取浙江省结核分枝杆菌临床分离菌株,常规培养,收集菌体,提取基因组DNA,采用聚合酶链反应(PCR)分别对VNTR位点进行检测分析,基因分型聚类分析采用BioNumerics软件。结果对71株结核分枝杆菌临床分离株的15个VNTR位点进行检测。结果显示明显的基因多态性。经基因聚类分析,可分4个基因群(Ⅰ群、Ⅱ群、Ⅲ群、Ⅳ群),58个基因型。分别为Ⅰ群占8.5%,含5个基因型,Ⅱ群占18.3%,含13个基因型,Ⅲ群占70.4%,含38个基因型,Ⅳ群占2.8%,含2个基因型。结论初步证实浙江省结核分枝杆菌VNTRs基因存在明显的多态性,至少存在4个VNTR型,主要流行型为Ⅲ型。

福建省2008-2017年人间布鲁氏菌病流行特征及分离株MLVA分型研究

目的探讨福建省人间布鲁氏菌病流行特征,并对其分离株进行分子分型,为制定预防控制策略提供依据。方法收集中国疾病预防控制信息系统中2008-2017年福建省布鲁氏菌病报告数据,进行流行特征分析;采用传统生物学鉴定和BCSP31-PCR、AMOS-PCR、MLVA-16进行布鲁氏菌分离株分子鉴定和分型,并进行聚类分析。结果福建省2008-2017年布鲁氏菌病发病呈逐年上升趋势,年均发病率0.11/10万;疫情波及福建省80%的县区,呈高度散发态势;发病高峰为4-8月;40～64岁发病数占62.7%,60～64岁组发病率最高(0.27/10万);男女比为2.50∶1,农牧民占50.7%。40株布鲁氏菌分离株分子检测结果与传统分型基本相符,为2个种(羊种和猪种)和2个生物型(羊3型和猪3型),其中羊种布鲁氏菌占绝大多数(87.5%);MLVA-16分型将其分为羊种和猪种2个种群,35株羊种菌分为28种基因型,5株猪种菌分为4种基因型,其中26种基因型为单分离株,6种基因型为共享基因型(共14株,35.0%)。同国内147株布鲁氏菌进行聚类分析显示,福建省菌株与广东和内蒙古地区存在4种共享基因型,均为羊种菌,其他部分菌株与外省菌株存在着较近的遗传距离,主要集中在panel 2B上,仅存在1～3个位点的差异。结论福建省布鲁氏菌病流行强度逐年增高,建议相关部门加强传染源的管控、对疫情高发地区的重点人群采取必要防控措施,控制其发生与流行。福建省布鲁氏菌MLVA-16分型显示高度基因多态性,提示MLVA-16可用于遗传多样性分析和分子流行病学溯源调查,可以提高布鲁氏菌病监测能力。

220株结核分枝杆菌北京临床分离株的基因分型研究

目的了解结核分枝杆菌北京临床分离株的基因分型种类和特征,为结核病防治研究提供基础科学依据。评价两种分型方法在北京地区结核病分子流行病学中的应用。方法收集北京市结核分枝杆菌临床分离株,应用间隔区寡核苷酸分型(Spoligotyping)及多位点可变数目串联重复序列分析(MLVA)二种分型方法进行基因分型,结果聚类分析采用BioNu-merics(Version5.0)软件。结果共在北京地区收集到220株结核分枝杆菌临床分离株。采用Spoligotyping分型方法,220株菌可分为2个基因群,即北京家族(Beijing family)和非北京家族(non-Beijing family),20种基因型。其中北京家族含有202株菌,占91.82%。北京家族菌株中,典型北京家族菌株占95.05%(192/202),非典型北京家族占4.95%(10/202)。北京家族菌株的耐药率为22.55%(22/98),非北京家族菌株的耐药率为16.67%(1/6),两者间的差异无统计学意义(fisher analysis,P=0.5835>0.05)。采用MLVA分型方法,202株菌可分成5个基因群59种基因型,主要为Beijing family、China2和China3,分别占91.37%、2.73%和4.55%。结论北京地区结核分枝杆菌具有明显的基因多态性,其主要流行型为北京家族。北京家族菌株与耐药性无明显相关性。

抽动秽语综合征汉族患者的执行功能及与多巴胺D4受体第3外显子48bp可重复序列多态性

目的:了解多巴胺D4受体基因第3外显子48bp可重复序列多态性(DRD4 exonIII NTR)与抽动秽语综合征(Gillesdela Tourette syndrome,GTS)患者执行功能缺陷之间的关系。方法:对86例GTS患者进行威斯康星卡片测验(Modified Wisconsin Card sortingtest,WCST)、Stroop色词测验(Strooptest)和连线测验,并和51例正常对照组进行比较;利用PCR技术对GTS患者进行了DRD4exonIII48bpVNTR分析。结果:与正常对照组比较,GTS组在Stroop测验中的C错误数[(44.39±65.3)vs.(20.50±10.85),P<0.01]等(包括C纠错数、C时间、CW正确数、CW错误数、CW纠错数和CW时间)、连线测验A时间[(69.80±25.84)vs.(35.69±8.25),P<0.01](包括连线B时间、错误数、犯规数)、WCST正确数[(44.39±65.37)vs.(27.49±10.85),P<0.01](错误数、持续错误数、非持续错误数和分类数)等测验项目上成绩较差,从共病情况来看,注意缺陷多动综合征共病组在Stroop测验部分项目上比单纯GTS组要差;从GTS组内分析来看,DRD4exonIII48bpVNTR和各神经心理学测验成绩没有关联。结论:抽动秽语综合征患者存在执行功能缺陷,DRD4exonIII48bpVNTR和抽动秽语综合征执行功能缺陷之间可能没有关联。

云南省剑川县鼠疫疫源地分离菌株基因组多态性

目的阐明云南剑川野鼠疫源地鼠疫菌种群的演化及其与云南省其他疫源地菌株之间的遗传进化关系。方法按不同时间、不同疫点、不同分离源,随机选取24株剑川分离鼠疫菌进行研究;采用差异区段(DFR)、规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPRs)及多位点可变数目串联重复序列分析(MLVA)进行基因组多态性分析;以DFR+CRISPRs聚类分析划分簇,再以MLVA26对簇进行聚类分析。结果24株剑川菌株中,20株菌聚为一个簇(剑川野鼠鼠疫簇);2017年疫情分离3株菌位于丽江野鼠鼠疫簇,与丽江菌株(2017LZ)存在2个位点的差异(N2577,M23);剩余1株为一个独立株;50年代菌株与其邻近的80年代菌株间位点差异未超过3。结论剑川原野鼠疫源地的发现时间可往前推至上世纪50年代,同时疫情还波及过家鼠和人群;剑川县境内存在2种类型的野鼠疫源地,其鼠疫防控具有复杂性,应继续加强鼠间鼠疫的动态监测。

老年住院患者肺炎克雷伯菌临床分离株多位点可变数目串联重复序列基因分型特征分析

目的探讨老年住院患者肺炎克雷伯菌分离株多位点可变数目串联重复序列分析的基因分型特点。方法收集解放军总医院南楼临床部老年住院患者肺炎克雷伯菌临床分离菌株184株,提取基因组DNA,采用多重PCR和毛细管电泳对7个位点进行分析,利用Bio Numerics 5.1软件进行聚类分析。结果 184株肺炎克雷伯菌临床分离株共产生139种基因型,呈现明显的基因多态性;聚类分析结果显示,全部菌株可分为3个基因群,其中Ⅰ群包含93.06%的菌株。结论本医疗中心老年住院患者的肺炎克雷伯菌临床分离株具有明显的优势菌群,其感染来源仍以院内感染为主。

辽宁省炭疽芽胞杆菌MLVA分型研究

目的了解辽宁地区炭疽芽胞杆菌的流行特征及菌型基因特征。方法通过多位点可变数目串联重复序列(Multiple locus variable numbers of tandem repeats analysis,MLVA)分型实验,对2001—2011年辽宁省分离到的6株炭疽芽胞杆菌分离株DNA进行检测,DNA指纹图谱使用BioNumerics 4.0软件进行统计分析,得出聚类分析结果。结果聚类分析发现,6株炭疽芽胞杆菌株可分为2个基因型。对于炭疽暴发而言,其可变数目串联重复序列遗传标记具有高度相似性。结论炭疽芽胞杆菌基因组中的串联重复序列可作为炭疽芽胞杆菌基因分型的指标,在炭疽暴发事件中的病原体溯源上具有重要的意义。

儿童结核病101例临床分离结核分枝杆菌多位点串联重复序列分型

目的了解重庆地区儿童结核病中结核分枝杆菌临床分离株的数目可变串联重复序列(variable numbertandem repeats,VNTR)的分布特征,寻找适合的VNTR位点组合。方法采用多位点串联重复序列(multiple locus VNTRanalysis,MLVA)分型方法,选择标化的24个VNTR位点,对101例结核分枝杆菌临床分离株DNA进行检测,结果采用BioNumerics 6.1数据库软件进行聚类分析和单位点Hunter-Gaston分辨率指数(Hunter-Gaston index,HGI)分析,并比较分析国际推荐的分组(12、15、24位点)的基因分型鉴定能力。结果 MLVA分析结果显示24个VNTR位点在不同菌株中存在明显的多态性,101例结核分枝杆菌临床分离株可分为1个基因群83种基因型,其中69种基因型只有1个菌株,占68.32%(69/101),另有32株临床分离株表现出14种基因型,占31.68%(32/101),成簇率为17.82%;24个VNTR位点的HGI具有较大差异(0.168～0.829),HGI能达到0.5以上的VNTR位点数有16个;24个VNTR位点进行不同的位点组合:12、15个和24个位点组合的HGI分别为0.995、0.996、0.996。结论 重庆地区儿童结核病中结核分枝杆菌存在基因多态性,国际推荐的15个VNTR位点组合的MLVA分型方法适用于其流行病学的研究。

2018年江苏省人感染布鲁氏菌分离株分子特征分析

目的掌握江苏省2018年人感染布鲁氏菌主要流行株的种型和基因型。方法运用普通PCR及AMOS多重PCR确认分离株的生物种型;采用多位点序列分型(Multilocus sequence analysis,MLSA)和多位点串联重复序列分析(Multiple-locus variable number tandem repeat analysis,MLVA)鉴定基因型,并与国内外流行株进行聚类分析。结果2018年共分离到56株布鲁氏菌,MLSA分型显示一株菌为猪种布鲁氏菌ST(Sequence type)17型,其他均为羊种布鲁氏菌ST8型。MLVA将56株菌分为47个基因亚型(46个羊种,1个猪种),聚类显示羊种布鲁氏菌全部为“东地中海簇”。结论2018年江苏省人感染布病主要为“东地中海簇”的ST8型羊种布鲁氏菌,并首次发现一例人感染ST17型猪种布鲁氏菌。

上海部分地区儿童艰难梭菌相关性腹泻的临床分析

本文旨在监测儿童腹泻中艰难梭菌相关性腹泻(CDAD)的发病情况,并对其进行回顾性临床分析。对复旦大学附属儿科医院2007年2月～9月111例腹泻患儿的粪便标本进行艰难梭菌毒素A检测及粪便厌氧菌培养,对所有患儿进行回顾性病史采集及分析,并对粪便培养所得的4株艰难梭菌菌株用多位点可变数目串联重复序列分析(MLVA)技术进行同源性分析。111例患者中,艰难梭菌毒素A检测及艰难梭菌培养均为阳性者无,艰难梭菌毒素A阳性而艰难梭菌培养阴性者16例,艰难梭菌毒素A阴性而艰难梭菌培养阳性者4例,艰难梭菌毒素A及艰难梭菌培养均阴性者91例。比较院内、院外组3种不同病程腹泻CDAD的发病率,无显著差异。MLVA分析发现粪便培养得到的4株艰难梭菌菌株有部分同源性。结果提示,目前上海部分地区儿童CDAD发病情况为散发,但彼此之间有部分同源性;院内、外获得性腹泻的CDAD发病率无显著差异;艰难梭菌毒素A阳性或艰难梭菌培养阳性的病例在临床表现上与艰难梭菌毒素A阴性且艰难梭菌培养阴性的腹泻病例无显著差异。

用MLVA技术和多重PCR对犬种布氏菌基因分型

目的:对犬种布氏菌的遗传关系进行不同分子分型方法的对比研究,为犬布病分子流行病溯源提供有效方法。方法:采用多重PCR和多位点可变数量串联重复序列分析(MLVA)方法对24株犬种布氏菌的遗传关系进行比较研究。结果:多重PCR只鉴定出1株犬种布氏菌,其余23株均鉴定为猪种鲁氏菌,但不能鉴定型别;MLVA方法对已鉴定为猪种的布氏菌仍可再细分为型,87%(20/23)为猪3型,13%(3/20)为猪1型。结论:MLVA可以对布氏菌种(生物型)进行基因分型鉴定,可以作为传统表型鉴定方法的补充。

肺炎支原体耐药性及分子流行病学研究进展

肺炎支原体是临床上非典型性肺炎常见的致病菌,主要采用大环内酯类抗菌药物治疗。近年来,肺炎支原体对大环内酯类耐药性日趋严重,且全世界各地耐药率存在差异,目前认为其耐药机制主要与23S rRNA V区基因位点突变(2 063位和2 064位)相关。根据肺炎支原体菌株P1基因序列的不同,应用聚合酶链式反应-限制片段长度多态性分析(PCR-RFLP)可分为Ⅰ型和Ⅱ型,其流行基因型随地区和时间的不同而不同。另外,为了解肺炎支原体耐药菌株之间是否存在克隆传播,可采用多位点可变数量串联重复序列分析(MLVA)方法分析肺炎支原体克隆型。加强肺炎支原体的耐药性及流行基因型的监测,有助于了解肺炎支原体的流行病学特点,为新型抗菌药物及疫苗的研发提供依据。

荧光定量聚合酶链反应联合拷贝数变异测序技术在产前诊断中的应用研究

目的:回顾性分析采用荧光定量聚合酶链反应(QF-PCR)联合全基因组拷贝数变异测序(CNV-Seq)技术对270例胎儿常见染色体非整倍体进行快速产前诊断并检测>100 kb的全基因组拷贝数变异的检测结果。方法:对270例早中孕期因产前血清学筛查异常或母亲血胎儿游离DNA(无创DNA)行产前筛查结果提示高风险孕妇人群进行产前诊断的羊水样本,通过短串联重复序列(STR)位点比对后行13、18、21、X、Y染色体非整倍体的快速诊断并联合高通量DNA测序法CNV-Seq技术对染色体全基因组拷贝数变异进行检测;同时与染色体核型结果进行比较和分析。结果:QF-PCR结果中胎儿5种常见染色体(13、18、21、X、Y染色体)非整倍体共计19例,阳性率7.03%(19/270),其中21三体12例,18三体3例,XXY综合征2例,XYY综合征2例。染色体核型提示非整倍体结果与此一致。二者染色体非整倍体检出率和准确性一致。染色体核型结果中尚有11例染色体多态性。CNV-Seq异常总数43例,阳性率15.9%(43/270);其中19例为染色体非整倍体,24例微缺失微重复(明确致病CNV-Seq 9例,致病性未知CNV-Seq 5例,良性可能CNV-Seq 10例)。QF-PCR联合CNV-Seq技术检测周期平均1~2周左右,而染色体核型检测周期5周左右且有1例培养失败(后重新羊膜腔穿刺采集羊水标本)。结论:QF-PCR联合CNV-Seq技术在临床上可快速准确筛查产前高风险孕妇人群,有利于二级预防实施和减少出生缺陷,提高优生优育。

贝叶斯判别分析在布氏杆菌常见种别鉴定中的应用

目的建立布氏杆菌常见种别的Bayes判别模型,为布氏杆菌种别的鉴定提供依据。方法以多位点可变数目串联重复序列分析方法所选择的基因组上16个具有多态性串联重复序列位点为判别指标,应用逐步判别分析方法筛选关键序列位点并构建布氏杆菌常见种别的Bayes判别模型。结果待选的16个多态性串联重复序列位点全部进入判别函数,建立的模型自身验证的准确率为98.21%,交互验证的准确率为97.75%。结论建立的Bayes判别模型判断布氏杆菌的常见种别正确率很高,是布氏杆菌常见种别判断的有效方法。

吉林省110株结核分枝杆菌临床分离株MLVA基因分型

目的:利用多位点可变数目串联重复序列(MLVA)分型技术,了解近期吉林省结核分枝杆菌临床分离株基因型分布情况。方法:收集分离自吉林省2011—2012年不同市县来源患者标本的结核分枝杆菌分离株,提取基因组DNA,对12个数目可变串联重复序列(VNTR)位点进行扩增和产物电泳分析,使用Totalab软件对电泳条带进行数据化分析,使用BioNumerics(6.0)软件获得聚类分析结果。结果:对110株结核分枝杆菌临床分离株的12个VNTR位点进行检测,结果显示这些菌株有明显的多态性。12个VNTR位点中Hunter-Gaston指数能达到0.5以上的VNTR位点有9个,位点分辨能力最高的是MIRU26,最低的是MIRU20。基于12个位点的聚类分析,110株分离株可分为6个基因型群,其中分布最多是5群,占34%;其次是1群,占15%。分布最多的5群主要流行于吉林省通化市和松原市等地区。结论:吉林省流行的菌株存在着明显的遗传多态性;不同市县分布的主要基因型群存在差异,表明吉林省内不同地区结核分枝杆菌基因型的流行趋势不同。

127株结核分枝杆菌基因分型及耐药相关研究

目的研究山西省长治及周边地区结核分枝杆菌的基因多态性及基因型与耐药的相关性。方法收集结核分枝杆菌临床分离株,运用MLVA方法进行基因分型,对8种抗结核药物分别采用比例法进行药敏试验,应用BioNumerics 5.0软件进行聚类分析。结果 15个位点中Mtub21、MIRU26和ETRE多态性较高(HGI>0.6),MIRU40、ETRB、MIRU16、ETRD、MIRU23和ETRC位点多态性较低(HGI<0.3)。127株结核分枝杆菌共分为11个基因群102种基因型,90株为独特型,基因群中Ⅰ群所占比例最大(80.31%)。127株菌株对一线和二线抗结核药物的总耐药率分别为47.24%和23.62%。一线药物中链霉素(40.94%)的耐药率最高,乙胺丁醇(6.30%)最低。二线药物中左氧氟沙星(14.17%)的耐药率最高,丙硫异烟胺(3.15%)最低。链霉素的单耐药率最高(11.81%);耐多药率为21.26%(27/127);广泛耐多药率为3.15%。Ⅰ群菌株的耐药率与其它菌株的差别无统计学意义。结论初步证实山西长治及周边地区的结核分枝杆菌具有明显的多态性,Ⅰ群为主要流行群。结核分枝杆菌对二线药物的敏感性高于一线药物。主要流行菌株Ⅰ群菌株与耐药无明显的相关性。

宁夏布鲁氏菌多位点串联重复序列分型研究

目的分析宁夏布鲁氏菌多位点串联重复序列分型特征。方法采用传统细菌学和分子生物学方法鉴定菌株,对16个可变数目串联重复序列位点进行PCR扩增,产物经毛细管电泳测序,生物信息学软件Bio Numerics进行聚类分析。结果经细菌学和分子生物学方法鉴定近期宁夏人群感染分离44株布鲁氏菌均为羊种布鲁氏菌,对选取的20世纪分离的24株菌重新鉴定结果为羊种12株、牛种3株和猪种9株。多位点串联重复序列分析方法(MLVA)分型结果显示,68株菌被分为8大基因群39个基因型,并将羊种、牛种和猪种布鲁氏菌分成3个基因群,其中56株羊种菌分为33个基因型,基因型存在地域性分布特点,同一基因型的部分菌株具有流行病学关联。结论 MLVA分型方法能将布鲁氏菌在种的水平上区分,宁夏感染人体布鲁氏菌具有丰富的遗传多样性,部分菌株采用MLVA分型方法结合流行病学资料可溯源。

基于全自动毛细管电泳技术建立的单核细胞增生李斯特氏菌MLVA分型方法

目的建立针对食品来源的单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes,Lm)分离株的多位点串联重复序列分型(Multiple-Locus Variable number tandem repeat Analysis,MLVA)方法,为暴发确认和溯源检测提供实验室支持。方法对2005—2014年间分离自食品的91株Lm进行14个可变数目串联重复序列(Variable Number of Tandem Repeats,VNTR)位点的检测,评估最优检测位点组合并分析检测结果。结果通过采用软件分析,由LMV1、LMV2、LMV7、Lm10、Lm11、Lm23、LM-TR6、TR3和Lm15等9个VNTR位点组成的位点组合为最优MLVA检测位点,可以将91株Lm分离株分为70个型别,分型能力达到0.987 1。结论本研究建立的基于全自动毛细管电泳的由9个检测位点组成的Lm的MLVA分型方法,具有操作简便、快速、结果客观、操作标准化、易于在不同实验室间比较的优势,可作为一线检测方法用于李斯特菌病的暴发确认和溯源检测。