用MAPs制备新肿瘤相关基因1 A6/DRIM的多克隆抗体

目的 :获得 1A6 /DRIM的N端特异性抗体并对其在细胞内的定位进行分析。方法 :针对 1A6 /DRIM的N端多肽用多通道同步固相全自动合成系统合成 ,以无免疫原性的赖氨酸结构为核心偶联 ,将此多聚抗原肽 (mutipleantigenicpeptides,MAPs)免疫新西兰大白兔 ,从免疫兔血清中获得 1A6 /DRIM的多克隆抗体。结果 :用WesternBlot技术证明了 1A6 /DRIM的N端抗体 ,与C端特异性单克隆抗体识别相同的 1A6 /DRIM基因表达的 31 0 0 0 0蛋白条带 ,经过WesternBlot和免疫荧光的方法初步证实 1A6 /DRIM在多种胃癌细胞系、乳腺癌细胞系以及肝癌细胞系中表达 ,免疫荧光显示 1A6 /DRIM主要定位在细胞核内。结论 :对于用谷胱苷肽巯基转移酶 (Glutathion S transferase ,GST)融合蛋白方法不能诱导表达的蛋白 ,可利用合成MAPs制备抗原的方法获得抗体。本研究用此方法制备的抗体特异性识别 1A6

MAPs技术合成抗原肽在戊型肝炎诊断中抗原性初探

目的 将多聚抗原肽 (MAPs)技术用于免疫测定 ,为诊断戊型肝炎寻找更好的诊断试剂盒。方法 根据戊型肝炎病毒 (HEV)开放阅读框架 2 (ORF2 )中含有的抗原表位 ,从戊型肝炎病毒中国株蛋白的氨基酸序列中选取S 30段抗原肽 ,用固相合成法分别进行化学合成普通线形抗原肽和MAPs肽段 ,并用ELISA分别检测其抗原性。结果 与国外试剂盒相比较 ,两者的符合率有差异。但MAPs肽段的符合率高于普通线形抗原肽 ,在检测灵敏度、特异性上MAPs肽段明显优于普通线形抗原肽。结论 以单一的戊型肝炎的抗原表位肽检测戊型肝炎存在漏检。在MAPs技术的基础上 ,合成多肽抗原的灵敏度得到明显提高。

用多抗原肽(MAP)免疫制备单克隆抗体的研究

用多抗原肽（ＭＡＰ）免疫制备单克隆抗体的研究丛进阳盖晓东（清华大学北京１０００８４）目前制备单克隆抗体杂交瘤细胞株的传统方法是用纯度很高的天然蛋白作为抗原来免疫动物。此方法虽然成功率很高，但提取和纯化作为抗原用的高纯蛋白确非常困难，在某些情况下甚至是...

基于MgPa模拟表位的MAP的制备、纯化与鉴定

目的制备含有生殖支原体黏附蛋白(MgPa)模拟表位的多抗原肽(MAP),为研制基于模拟表位的MAP用于Mg的诊断与预防提供前期实验基础。方法以多聚赖氨酸为核心基质,采用Fmoc方法合成含有MgPa模拟表位的八分枝MAP,反向高效液相色谱(RP-HPLC)分析MAP的纯度,质谱分析法测定MAP的分子量以期对其进行鉴定。结果分别制备了含有MgPa 3个模拟表位的MAP,RP-HPLC分析的结果表明合成的3个MAP的纯度都在90%以上,质谱分析的结果说明所合成的MAP的分子量与预期的理论分子量相符。结论成功制备、纯化并鉴定了3个含有MgPa模拟表位的MAP。

MAP法制备抗人Connexin31抗体

MAP(multipleantigenicpeptide)多肽法具有快速、简便、成本低廉的特点.用MAP法,直接在多肽合成仪上合成Connexin31羧基端一个多肽片段(250-266AA)的MAP肽,经超滤器纯化后,免疫新西兰雄兔后采血检测、并纯化.经Westernblotting、细胞免疫荧光染色、免疫沉淀证实得到的抗体为抗间隙连接蛋白31的特异抗体.

血吸虫多抗原肽疫苗的合成及生物活性

目的：合成由寡聚赖氨酸和曼氏血吸虫２８ＫｕＧＳＴ抗原肽段２６４３（Ｐ２６）、１４１１５３（Ｐ１４１），日本血吸虫２６ＫｕＧＳＴ抗原肽段１８７２０２（Ｊ１８７）组成的血吸虫多抗原肽疫苗，通过活性试验考察其抗原性及对实验动物的保护性免疫效果。方法：用固相逐步接肽法合成多抗原肽疫苗，产物经斑点酶联免疫吸附试验测定抗原性，并在无免疫佐剂存在下接种小鼠，以日本血吸虫尾蚴攻击感染，６周后剖杀小鼠进行体内成虫和肝内虫卵计数。结果：合成多抗原肽均能与感染日本血吸虫的病人或病兔血清结合，接种（Ｐ１４１）４ＭＡＰ、（Ｊ１８７）４ＭＡＰ的昆明小鼠和接种（Ｐ２６）８ＭＡＰ的ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，与对照组相比成虫检获数分别减少６４６％，４１３％和２８１％；每克肝脏虫卵数分别减少５４９％，４５６％和４０６％。结论：合成血吸虫多抗原肽疫苗能诱导小鼠产生抵抗日本血吸虫感染的保护性免疫力。

猪圆环病毒2型Cap蛋白核定位信号区抗原表位的鉴定

【目的】猪圆环病毒2型(PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)的重要病原,其基因组ORF2编码的Cap蛋白为病毒的主要结构蛋白,起保护性抗原作用,对其进行抗原表位鉴定十分必要。【方法】本研究采用杆状病毒表达的重组Cap蛋白作为免疫原制备5株单克隆抗体,通过原核表达系统对ORF2基因进行了截短表达,先行对Cap蛋白抗原表位进行宽幅定位,然后利用合成多肽对Cap抗原表位做精确扫描定位。【结果】5株单抗中有4株针对同一抗原表位,坐落在Cap蛋白N末端核定位信号区,经多肽扫描证实,核心序列为26RPWLVHPRHRY36;另1株单抗(1D2)仅与重组Cap蛋白产生免疫活性反应,对4个分段截短表达的Cap蛋白无免疫活性反应,鉴于该单抗具有中和病毒活性,针对的可能是构象表位。【结论】本研究首次鉴定出位于Cap蛋白核定位信号区的一个抗原表位,为以后Cap蛋白功能及核定位机理的研究奠定基础。

基于可重复利用免疫磁珠的抗体检测方法的建立

目的基于可重复利用的免疫磁珠,建立一种简捷快速的特异性抗体检测方法。方法设计人类巨细胞病毒(humancytomegaloviruses,HCMV)PP150蛋白的抗原表位,并合成8分枝多聚抗原肽PP150-8MAPs。将PP150-8MAPs以共价结合形式包被于DynabeadsM-450Tosylactivated磁珠表面,制备特异性免疫磁珠。用PP150-8MAPs免疫Balb/c小鼠制备抗此抗原表位的标准抗血清。应用免疫磁珠检测标准抗血清中的抗体,优化检测条件。在抗体检测反应结束后,洗脱抗体-二抗复合物,再生后的免疫磁珠重复用于标准抗血清样品的检测分析,并分析免疫磁珠可重复利用的次数。结果制备免疫磁珠时,PP150-8MAPs的最佳包被量为100μg/mL,包被效率为79%。用PP150-8MAPs免疫小鼠后,得到的抗血清滴度可达到112800。用免疫磁珠法检测小鼠标准抗血清,免疫磁珠可重复进行20次以上的检测分析。结论基于酶联免疫检测方法,包被抗原的免疫磁珠可重复应用于血清样品中特异性抗体的检测分析。此实验为建立一种新的可重复检测的高效清样品中特异性抗体的检测分析。此实验为建立一种新的可重复检测的高效免疫磁珠抗体分析方法奠定了基础,在基础研究与临床检测中具有广泛的应用前景。

多靶点抗原肽自体免疫细胞治疗原发性肝细胞癌的临床安全性

目的:评价多靶点抗原肽自体免疫细胞技术(multiple antigen stimulating cellular therapy,MASCT^(TM))治疗原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的临床安全性。方法:回顾性分析2012年1月至2014年12月南方医院肝病中心收治的接受MASCT^(TM)治疗且治疗前的末次治疗结束最少1个月以上、未接受其他免疫治疗的45例HCC患者的临床资料。第0天分离患者外周血单个核细胞,其中贴壁细胞诱导培养为成熟树突状细胞(muture dendritic cell,mDC),负载14种抗原肽,小部分mDC于第8天经患者腹股沟淋巴结周围区皮下注射;未贴壁细胞第7天与大部分mDC共培养诱导为杀伤性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL),对mDC及CTL进行质量控制检测,第26天经静脉回输患者体内,分析输注细胞后患者的不良反应和血常规、肝肾功能变化。结果:mDC中CD80^+细胞比例为(98.5±5)%、CD83^+细胞为(88.0±10)%、CD86^+细胞为(98.4±3)%、HLA-DR^+细胞为(98.8±2)%,mDC分泌高水平IL-12[(985±312)pg/ml]、低水平IL-10[(53±10)pg/ml]。CTL中CD3^+CD8^+细胞为(83.0±10)%、CD3^+CD56^+细胞为(24.0±5)%,CTL分泌高水平IFN-γ[(1 222±650)pg/ml]、低水平IL-10[(7±5)pg/ml]。MASCT^(TM)治疗后,绝大多数患者的精神、食欲、睡眠和体力较前好转,有2名(4.4%)患者在输注CTL细胞1 h后出现轻中度发热,未观察到其他严重明显不良反应。患者的血常规、肝肾功能均无明显异常变化。结论:MASCT^(TM)成功诱导培养典型mDC和CTL,行MASCT^(TM)治疗的HCC患者不良反应较少,临床应用安全性良好。

一种山羊支原体山羊肺炎亚种多重抗原肽的小鼠免疫试验

旨在构建一种由山羊支原体山羊肺炎亚种(Mycoplasma capricolum Subsp.capripneumoniae,Mccp)六个B细胞表位和三个T细胞表位组成的多重抗原肽(multiple antigenic peptide,MAP),将其在大肠杆菌中表达后免疫小鼠,评估其体液免疫和细胞免疫。分别用MAP、单个B细胞表位及全菌超破抗原作为抗原,检测免疫小鼠抗体水平,结果显示三种抗原均能和小鼠免疫血清发生很好的反应(P<0.01)。体外代谢抑制试验显示,1∶64倍稀释的免疫小鼠血清可以有效抑制Mccp的生长。淋巴细胞增殖试验显示,当用单个T细胞表位及Mccp超破抗原分别刺激免疫小鼠的淋巴细胞时均产生明显的增殖现象(P<0.01)。细胞因子检测结果显示,免疫小鼠的IFN-γ、TNF-α、IL-1β和IL-10产量明显升高(P<0.001),而IL-12产量明显下降(P<0.001)。数据显示,构建的MAP能够引起小鼠的免疫反应,这一结果为由Mccp引起的山羊传染性胸膜肺炎亚单位疫苗的研制奠定了一定的基础。

含两种不同肽段的血吸虫多抗原肽疫苗的合成与生物活性

目的：合成由曼氏血吸虫２８ Ｋｕ ＧＳＴ抗原肽段２６４３（Ｐ２６）、１４１１５３（Ｐ１４１）和日本血吸虫２６ Ｋｕ ＧＳＴ 抗原肽段１８７２０２（Ｊ１８７）中的两种不同肽段组成的血吸虫多抗原肽疫苗，通过活性试验考察其抗原性、免疫原性及对实验动物的保护性免疫效果。方法：用Ｂｏｃ 化学和Ｆｍｏｃ 化学相结合的策略合成含两种不同抗原肽的多抗原肽疫苗，产物经斑点酶联免疫吸附试验测定抗原性，在无免疫佐剂存在下接种小鼠，ＥＬＩＳＡ 试验检测血清抗体，并用日本血吸虫尾蚴攻击感染，６ 周后剖杀小鼠进行体内成虫和肝内虫卵计数。结果：合成多抗原肽能不同程度地与感染日本血吸虫的病人或病兔血清结合，并能诱导昆明小鼠产生对日本血吸虫天然抗原特异的抗体应答。接种（Ｐ２６）２（Ｊ１８７）２ＭＡＰ、（Ｐ２６）２（Ｐ１４１）２ＭＡＰ和（Ｐ２６）４（Ｐ１４１）４ＭＡＰ的昆明小鼠，与对照组比较成虫检获数分别减少４０－１ ％ ，６１－１ ％ 和３４－４％ ； 每克肝脏虫卵数分别减少４８－４％ ，６７－１ ％ 和４７－４％ 。结论：含两种不同抗原肽的合成血吸虫多抗原肽疫苗能够诱导昆明小鼠产生显著的抗日本血吸虫感染的保护性免疫力。

乙肝病毒新型免疫原性多肽的设计、合成

在乙肝病毒高分辨率免疫识别的基础上，以Ｐｒｅ－Ｓ２蛋白的优势Ｂ细胞表位Ｂ１、Ｂ２为基础，引入不同的Ｔｈ细胞表位Ｔｈ１、Ｔｈ２，结构参照ＭＡＰ设计，采用固相合成法，合成了ＭＡＰ１和ＭＡＰ２。产物经毛细管电泳分析和氨基酸组分鉴定。

肿瘤抗原MAGE-2多抗原肽疫苗的设计合成及免疫原性研究

目的 采用多抗原肽 (multipleantigenpeptide ,MAP)设计方案 ,提高线性短肽的免疫原性。方法 对肿瘤抗原MAGE 2 2 2 0 2 2 8细胞毒性T细胞 (cytotoxicTlymphocyte ,CTL)表位进行分子修饰 ,设计、合成四分支多抗原肽 (MAP4)。标准Fmoc合成方案进行合成 ,液相色谱 质谱联用 (LC MS)进行目的肽鉴定。以体外刺激人外周血单核细胞 (PBMC)诱导CTL效应及IFN γ分泌 ,标准 51 Cr释放实验与Elispot实验进行免疫原性的研究。结果 标经准 51 Cr释放实验验证 ,低浓度的MAP4可以诱导出有效的CTL效应 ,Elispot实验显示MAP4能够有效诱导的IFN γ分泌。结论 MAP的构建能够增强CTL效应和IFN γ的分泌 。

丙型肝炎病毒HVR1抗血清体外阻断HCV的感染

目的 体外观察含HCV高变区1多抗原肽(MAP)及其抗血清对HCV感染有无阻断作用。 方法 将前期合成的MAP及其抗血清和HCV感染血清按不同比例充分混合并在37℃下孵育2h或4℃下孵育12h,再将此混合血清接种7721细胞,分别以逆转录-聚合酶链反应、免疫组化、原位杂交检测细胞的感染情况。 结果 各比例混合的阻断血清组在孵育后细胞和培养上清中均可检出HCV RNA;免疫组化证实有表达HCV抗原的阳性细胞。 结论 前期合成的HCV包膜糖蛋白及其抗血清在体外不能明确阻断HCV感染/吸附肝细胞。

多抗原肽免疫血清体外阻断丙型肝炎病毒感染树鼠句肝细胞的初步研究

目的 探讨多抗原肽 (MAP)免疫血清在体外能否阻断丙型肝炎病毒 (HCV)感染树鼠句肝细胞 ,为研制HCV分子疫苗提供实验基础。方法 用兔抗MAP血清分别与两份感染血清按一定比例混合后接种于原代培养的树鼠句肝细胞中 ,用逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)、免疫组化、原位杂交分别检测细胞内或上清中正负链RNA ,细胞内HCVNS3抗原的表达情况 ,以及原位检测细胞内HCV负链RNA。结果 1份HCVRNA阳性血清与兔抗MAP血清按 1∶1混合后接种于培养的树鼠句肝细胞中 ,细胞内可检出HCV正负链RNA ,并有HCVNS3抗原的表达 ,而另外 1份HCVRNA阳性血清与兔抗MAP血清按 1∶1、5∶1、10∶1混合后接种于培养的树鼠句肝细胞中 ,细胞内未检测出HCV正负链RNA ,也未见特异性抗原表达。结论 兔抗MAP血清在体外能部分阻断HCV感染。

肝素酶特异性细胞毒T淋巴细胞表位多抗原肽负载的树突状细胞疫苗体外抗肿瘤免疫效应研究

目的研究肝素酶(heparanase,Hpa)细胞毒T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)表位多抗原肽(multi-ple antigen peptides,MAP)疫苗能否诱导更强的Hpa特异性CTL反应。方法 HLA-A2.1限制性肝素酶CTL表位多抗原肽负载正常人外周血来源(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)树突状细胞(dendritic cell,DC),诱导CTL,采用4 h标准51Cr释放实验检测上述CTL对不同肿瘤细胞的免疫杀伤效应;采用ELISPOT实验检测效应细胞分泌IFN-γ的能力。结果肝素酶CTL表位MAP疫苗诱导的CTL对Hpa阳性且HLA-A2.1匹配的KATO-Ⅲ胃癌细胞、U2OS骨肉瘤细胞、SW480结肠癌细胞具有杀伤效应,且其杀伤效应强于相应的单肽,在最大效应细胞/靶细胞(effector/target,E/T)时高出率均大于16%;其对HLA-A2.1阴性的HepG2肝癌细胞和Hpa阴性的MCF-7乳腺癌细胞不具有杀伤效应,但是对MCF-7/Hpa乳腺癌细胞和HepG2/HLA-A2肝癌细胞具有杀伤效应,且其杀伤效应强于相应的单肽,在最大E/T时高出率均大于18%;其对自体淋巴细胞和DC不具有杀伤效应。另一方面人肝素酶CTL表位MAP疫苗诱导的IFN-γ分泌水平强于相应的单肽。结论肝素酶CTL表位MAP疫苗能激发较相应单肽更强的特异性和非特异性抗肿瘤效应。

HBV新型免疫原的设计、合成及免疫原性研究

目的 探讨如何将表位构建成有效免疫原。方法 以Pre S( 2 ) 蛋白两优势性B细胞表位和HBcAg两Th细胞表位为基础 ,设计、合成了 2种MAP多肽 ,以此两MAP肽为免疫原免疫兔和小鼠 ,观察体液免疫反应。结果 此两种MAP多肽均比Pre S( 2 ) 蛋白诱发更高抗体滴度 ;Th细胞表位引入可显著增强反应强度。结论 增加肽抗原结构复杂性可提高其免疫原性 ,其表位排列以B细胞表位在赖氨酸核心外侧为佳 。

不可分型流感嗜血杆菌OMP6优势T-B联合抗原表位及其免疫原性研究

目的了解无荚膜不可分型流感嗜血杆菌(NTHi)临床菌株P6外膜蛋白(OMP6)编码基因(omp6)分布及其序列保守性,筛选并鉴定OMP6序列中优势T和B细胞(T-B)联合抗原表位及其免疫原性。方法采用PCR扩增NTHi临床菌株全长omp6基因,T-A克隆后测序。采用生物信息学软件分析OMP6序列保守性与膜定位并预测其T-B联合抗原表位。采用噬菌体展示联合免疫印迹法和ELISA分别检测重组噬菌体PIII蛋白(rPIII)展示的OMP6中T-B联合抗原表位肽免疫原性和免疫反应性。结果 35株NTHi临床菌株均能检出omp6基因,其核苷酸和氨基酸序列相似性分别为98.3%~100%和99.3%~100%。OMP6为外膜表面蛋白,具有OMP6-2-25、OMP6-61-86和OMP6-98-126三个预测T-B联合抗原表位。Western Blot和ELISA结果显示,OMP6-2-25能与NTHi抗血清产生较强的杂交条带,96.9%(59/62)、69.4%(43/62)和74.2%(46/62)NTHi感染患儿血清标本OMP6-2-25、OMP6-61-86和OMP6-98-126抗原表位肽抗体阳性。结论 OMP6是分布广泛且序列保守的NTHi跨膜蛋白,OMP6-2-25为OMP6优势T-B联合抗原表位,可作为NTHi多抗原肽疫苗的候选表位。

人端粒酶逆转录酶表位多抗原肽疫苗的体外抗肿瘤免疫效应研究

目的检测基于人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)表位R540的多抗原肽(multiple antigen peptide,MAP)的体外抗肿瘤活性。方法将HLA-A2限制性hTERT CTL表位的多抗原肽负载正常人外周血来源(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)的树突细胞,并将负载多肽的树突细胞刺激淋巴细胞产生hTERT特异性的CTL细胞,采用51Cr释放实验检测所诱导的CTL细胞体外抗肿瘤杀伤效应。结果 hTERT特异性CTL表位的多抗原肽所诱导的CTL细胞对hTERT及HLA-A2表达均阳性的肿瘤细胞杀伤作用较之其单肽疫苗杀伤活性明显增强,在最大效靶比(E/T)80∶1时,高出率均大于25%。而对HLA-A2阴性的HepG2肝癌细胞及hTERT阴性的U2OS骨肉瘤细胞不具有杀伤效应,同时其对自体淋巴细胞和树突细胞也不具有杀伤效应。结论 HLA-A2限制性hTERT CTL表位多抗原肽相较于其单肽能在体外诱导更强的抗肿瘤免疫效应。

hTERT多表位肽致敏mDC诱导CTL对HLA-A24^+肿瘤细胞的特异性杀伤作用

目的:研究人工合成人端粒酶逆转录酶(hTERT)多表位混合肽经髓样树突状细胞(mDC)提呈后,诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对HLA-A24+肿瘤细胞的免疫杀伤效应。方法:人工合成四分支的树状串联hTERT表位肽(MAPs)及其各单表位多肽。取HLA-A24+健康志愿者的外周血,用免疫磁珠分选并培养mDC。用尼龙毛柱纯化T淋巴细胞并培养。以各表位肽致敏mDC后,诱导特异性CTL增殖,并以表达hTERT且以HLA-A24+肿瘤细胞株SMMC-7721及HLA-A24-肿瘤细胞株SKOV3为靶细胞行杀伤实验。用ELISA法检测不同时间点培养基上清液中IL-12、TNF-α的分泌量;用流式细胞术检测CTL对肿瘤细胞的杀伤效应。结果:以源于hTERT的T淋巴细胞表位I540(ILAKFLHWL)、V461(VYGFVRACL)及L766(LTDLQPYMRQFVAHL)合成4分支MAPs多肽及各单表位混合多肽。以人工合成的hTERT多表位混合肽致敏mDC后,能刺激CTL增殖,并可诱导对HLA-A24+肿瘤细胞株SMMC-7721的特异性杀伤作用,且MAPs多肽较单表位混合多肽的致敏效果更具显著性(P<0.05)。结论:以人工合成的hTERT多表位混合肽致敏mDC能激活同源淋巴细胞(CTL),可特异性杀伤HLA-A24+的肿瘤细胞,在肿瘤免疫治疗中具有重要的意义。