RPA检测技术在禽源病原检测中的研究进展

重组酶聚合酶扩增(recombinant polymerase amplification, RPA)是一种近年来研究者关注较多的新型恒温核酸扩增技术,该方法操作便捷、扩增速度快、特异性强及灵敏度高,无需借助精密仪器,且在恒温环境下(25~45℃)即可完成核酸检测,极有可能取代传统PCR检测技术。RPA检测技术迄今发展十余年,已广泛应用于细菌、病毒、真菌、寄生虫及耐药基因检测等领域,被认为是当前最有潜力的快速分子诊断工具,具有较为广泛的应用前景。笔者就RPA检测、技术优势、常见检测方式及其在禽源病原检测方面的研究进展进行概述,旨在为临床禽源病原新型检测技术的研究提供一定理论参考。

尖孢镰刀菌西瓜专化型RPA检测方法的建立与评价

[目的]构建了西瓜枯萎病菌——尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.niveum,FON)的重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)的快速检测体系,以期为田间西瓜枯萎病的快速检测提供技术支持。[方法]从NCBI网站下载包括西瓜枯萎病菌在内的11种病原真菌的基因组序列,利用SeqHunter 2软件进行生物信息学分析,经比对得到4个FON的特异性基因片段,并对其进行引物设计和筛选。利用聚合酶链式反应(PCR)验证引物的特异性和灵敏度,然后利用建立的RPA检测体系对引物的特异性和灵敏度进行验证,最后进行人工接种FON的西瓜植株的RPA检测与评价。[结果]建立了FON的RPA检测体系,并对DNA恒温快速扩增试剂盒的扩增体系进行最佳反应时间(40 min)和最适反应温度(30℃)的摸索,得到其最佳反应体系的检测下限为100 pg·μL^(-1)。利用DNA恒温快速扩增试剂盒(胶体金试纸条型)进行扩增时,只需在38℃反应12 min,取50μL稀释20倍的扩增产物用胶体金试纸条进行检测,5 min后即可进行结果的判断,检测下限为100 pg·μL^(-1)。[结论]成功构建FON的RPA检测体系,且建立的RPA检测体系能够从温室接种FON之后未显症的西瓜植物组织基因组DNA中检测到FON,可为田间西瓜枯萎病早期的快速检测提供技术支持。

空肠弯曲菌的侧向流RPA快速检测方法研究

目的:建立一种可现场快速检测空肠弯曲杆菌的方法。方法:应用重组酶聚合酶等温扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)技术,设计引物探针,建立侧向流RPA法,使用特异性、灵敏性实验对该方法进行验证。结果:实验所用的所有非空肠弯曲菌在侧向流试剂盒上都是阴性的,空肠弯曲菌都是阳性的;该方法的检出限为1.2×10^3 CFU/mL。结论:本研究制作的RPA技术制作的侧向流试剂盒特异性和灵敏性良好,简单快捷,具有较强的应用价值。

禽流感病毒H7亚型RT-exoRPA检测方法的建立

为了建立一种简便、快速的禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)H7亚型的检测方法,根据GenBank中禽流感病毒H7亚型的HA保守序列,并按照RPA引物探针的要求,设计多对引物及探针,通过条件的优化,建立禽流感病毒H7亚型RT-exoRPA检测方法,并与实时荧光定量PCR方法进行比较。特异性试验结果显示,该方法特异性强,只有禽流感病毒H7亚型出现特异性曲线;灵敏性试验结果显示,该方法能检测到禽流感病毒H7亚型最低浓度为0.24×10-3μg/mL,与实时荧光定量PCR方法相比,灵敏性稍差,但该方法的检测快速,仅需要20min。表明所建立的禽流感病毒H7亚型RT-exoRPA检测方法简单、快速,适合用于禽流感病毒H7亚型的现场检测。

出血性大肠埃希菌O157:H7可视化和实时荧光RPA检测方法的比较

目的以检测出血性大肠埃希菌(EHEC)O157:H7为目的,基于重组酶聚合酶扩增(RPA)技术,分别建立可视化RPA检测方法和实时荧光RPA检测方法。方法根据出血性大肠埃希菌O157:H7的rfbE基因设计引物和探针,进行特异性、灵敏度检测,建立实时荧光RPA检测方法。结合SYBR Green I在核酸反应中的颜色变化特征,设计可视化RPA检测方法。结果建立的实时荧光RPA检测方法和可视化RPA检测方法,分别在35℃时反应不超过25 min即可检测EHEC O157:H7。设计的引物和探针仅对EHEC O157:H7出现特异性结果。两种检测方法的检测限低于10-5 ng/μL。结论EHEC O157:H7的可视化RPA检测方法和实时荧光RPA检测方法操作简便,且特异性强、敏感性高,可为EHEC O157:H7的现场快速检测和实验室检测提供新方法。

A型动物流感病毒RT-RPA检测方法的建立及初步应用

根据A型流感病毒M基因核苷酸序列设计引物及探针,建立了一种灵敏度高、特异性强、检测迅速、操作简便的重组酶聚合酶扩增技术（RT-RPA）。选用常见动物疫病病原验证引物探针的特异性,设计多对引物及探针,筛选出最适反应体系及反应条件,并与实时荧光RT-PCR方法比较。结果显示,本研究建立的RT-RPA方法特异性强,只有A型动物流感病毒呈阳性,其他相关常见病原均为阴性;反应时间短,检测反应时间仅需20 min;灵敏度高,最低可检测到A型动物流感病毒核酸浓度为0.96×10-2g/mL。与实时荧光RT-PCR方法相比,其灵敏度稍低。本研究建立的检测A型动物流感病毒的RT-RPA方法特异性强,灵敏性高,操作简单,检测快速,适合现场检测以及在基层实验室推广应用。

禽流感病毒H5亚型RT-exoRPA检测方法的建立

为建立一种特异、灵敏、简便、快速的禽流感病毒H5亚型的检测方法,根据近几年流行的禽流感病毒H5亚型毒株HA基因序列,采用DNAStar生物分析软件进行基因序列比对后,选择相对保守区域,设计多对引物及探针,建立了禽流感病毒H5亚型RT-exoRPA检测方法,对该方法的反应条件进行优化并检测特异性和灵敏性。结果显示,建立的检测禽流感病毒H5亚型RT-exoRPA方法特异性强,只有禽流感病毒H5亚型呈阳性,其他均为阴性;灵敏性较高,最低可检测到质量浓度为0.89×10^-3 mg/L的禽流感病毒H5亚型核酸,比实时荧光RT-PCR方法灵敏性低10倍;检测快速,检测反应所需时间仅20min,比实时荧光RT-PCR方法缩短近1h。结果表明,所建立的禽流感病毒H5亚型RT-exoRPA检测方法适应于禽流感病毒H5亚型的现场检测,以及基层实验室的推广应用。

耐药基因bla_(TEM-1)、bla_(IMP-3)、fosA3多重重组聚合酶扩增(RPA)快速检测方法的建立和应用

为了建立同时检测多种耐药基因的快速检测方法,本研究以bla_(TEM-1)、bla_(TEM-1)、fosA3基因保守序列设计特异性引物,经优化反应条件,建立恒温检测上述3种耐药基因的多重重组聚合酶扩增(RPA)方法。条件优化结果显示,所建立的RPA方法在引物浓度为480 mmol/L,37℃恒温反应20 min时检测效果最佳。该方法对携带bla_(TEM-1)、bla_(TEM-1)、fosA3基因的菌株能扩增出条带,阴性菌株无条带,特异性高;对bla_(TEM-1)、bla_(IMP-3)基因的最低检出限为1.8×10^(1)拷贝/μL,对fosA3基因的最低检出限为1.8×10^(2)拷贝/μL,敏感性较强。用多重RPA方法对浙江省内水产养殖环境及生物体中分离到的400株菌株进行检测,养殖用水分离菌株的bla_(TEM-1)、bla_(TEM-1)和fosA3检出率分别为81.00%(81/100),11.00%(11/100)和29.00%(29/100);水产动物体内分离菌株的bla_(TEM-1)、bla_(IMP-3)和fosA3检出率分别为73.67%(221/300),1.33%(4/300)和23.33%(70/300),与常规PCR基本一致。建立的RPA方法操作简单、反应快速、检测限低、结果可靠,适用于多种耐药基因的快速检测,为快速摸清养殖产业链各环节的耐药基因谱,减少耐药基因传播,保障食品安全提供了技术支撑。

重组酶聚合酶扩增技术及其在动物病原快速检测中的应用

建立动物疫病的快速诊断,对于我国养殖业疫病的预防及控制、进出口检疫、动物食品安全卫生等方面具有重大意义。重组酶聚合酶扩增技术(RPA)是近几年出现的1种有望替代PCR的新的核酸扩增技术。该技术主要依赖于3种酶:能结合单链寡核苷酸引物的重组酶、单链DNA结合蛋白和DNA聚合酶。反应过程中不需要模板链的热变性,可以在恒定的低温条件下快速扩增DNA或者RNA。具有特异性强、灵敏度高、快速、操作简便、适用于现场快速诊断等特点,在动物疾病早期诊断、实地检测、进出口快速检疫等方面具有巨大的应用前景和市场。本文对RPA技术进行综述,以期为相关研究提供参考。

多重组等温聚合酶快速扩增技术在新冠病毒检测中的应用

目的探讨多重组等温聚合酶快速扩增技术(MIRPA)在新冠病毒检测中的应用价值。方法从GenBank数据库下载新冠病毒基因核苷酸序列,选取保守区域ORF1ab基因作为扩增对象,设计MIRPA检测的特异性引物。通过引物筛选、反应体系优化,建立检测新冠病毒的MIRPA方法,用建立的MIRPA方法检测人类冠状病毒OC43(HCoVOC43)、HCoV-229E、流感病毒B型(FluB)阳性咽拭子样本,评估其特异性;和实时荧光定量PCR检测结果比较,评估其准确度。结果针对新冠病毒ORF1ab基因序列设计合成引物和探针,建立MIRPA检测体系。用优化的MIRPA体系检测新冠病毒阳性参考品均为阳性,HCoV-OC43、HCoV-229E、FluB均为阴性;MIRPA方法的灵敏度为100拷贝/ml;和实时荧光定量方法的检测结果符合率达100.00%。结论建立的MIRPA方法检测新冠病毒的特异性强、灵敏度高,结果准确可靠,具有重要的经济和社会价值。