多重数字PCR在rAAV基因组完整性评价中的探索应用

目的:探索采用多重数字PCR(dPCR)技术评价重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus, rAAV)基因组完整性的可行性。方法:采用芯片式dPCR系统,针对rAAV基因组的末端反向重复序列(ITR)区和目的基因(或3’非翻译区)建立双重PCR法,通过适量稀释使模板DNA在PCR芯片中呈理论单拷贝分布(阳性孔低于20%),单阳性孔代表非完整片段,双阳性孔代表2组引物对之间的序列完整,通过测试单、双阳性孔的比例,评价rAAV基因组的完整性;尝试采用不同样品前处理方式(病毒基因组DNA、病毒颗粒、DNaseⅠ处理),并比较测试结果。结果:双重PCR测得拷贝数与单重PCR基本一致,无明显干扰;在一定范围内,样本的实测拷贝数与模板量呈线性相关,但单阳、双阳比例基本一致;提取的病毒基因组DNA实测拷贝数减少,但双阳率高于未处理病毒样本,DNaseⅠ处理后的病毒样本实测拷贝数明显减少,单阳、双阳比例与未处理病毒样本基本一致。结论:多重dPCR技术可用于评价rAAV产品基因组完整性,具有良好的应用前景。