河南省出血性大肠杆菌O157:H7监测研究

目的 为了解河南省E .coliO15 7∶H7感染性腹泻的分布特征、临床特点以及在家畜、家禽中的带菌状况和食物污染程度。方法 采用O15 7特异性筛查方法进行病原体分离培养 ,应用分子生物学、微生物学、生物化学技术进行病人、家畜、家禽的病原菌分离、培养、毒素因子测定。结果 2 0 0 0 - 2 0 0 2年从 384 0份标本中检出E coliO15 7∶H72 2 0株 ,其中 77株具有毒素基因 ;显示有 5个毒素因子组合型。结论 病例有明显的时间、职业分布 ,发病以 6 0岁以上年龄组为主。最佳采样时间应在感染后 5天内。E coliO15

MPCR检测食品中大肠杆菌O157和单核增生李斯特氏菌的研究

根据大肠杆菌O157(Escherichia coliO157,E.coliO157)的志贺样毒素基因slt和"黏附抹平"因子eaeA基因、单核增生李斯特氏菌(Listeria monocytohenes,LM)的编码溶血素O的hlyA基因和毒力基因plcA,分别设计上游和下游的slt、eaeA、hlyA和plcA四对引物,对应扩增片段依次为780、450、708、600bp。通过对单管多重PCR(multiplex PCR,MPCR)扩增的特异性、敏感性分析以及对单管多重PCR扩增条件,如Mg2+浓度、dNTPs浓度和退火温度等的优化,建立快速检测大肠杆菌O157和单增李斯特菌的多重PCR方法,该方法能同时检测到0.50ng的E.coliO157和单增李斯特菌基因组DNA,并且操作简便、快速,具有良好的敏感性和特异性,能够快速实现对食品中多种致病菌的诊断和监控。

多重实时聚合酶链式反应法快速检测食品中的产志贺毒素大肠埃希氏菌

目的建立多重实时聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)法快速检测食品中的产志贺毒素大肠埃希氏菌(Shiga toxin-producing Escherichiacoli,STEC)的方法。方法以产志贺毒素大肠埃希氏菌携带的毒力基因stx1、stx2和黏附基因eae靶基因引物探针建立多重实时PCR体系,并采用原位冻干技术将PCR反应体系和阳性质控品进行了预先分装冻干,制成稳定、便捷的即用型反应体系,随后对方法的灵敏性、特异性和稳定性进行评价。结果所建立的多重实时PCR法检测eae、stx1、stx2基因的灵敏性为102 CFU/mL。与32种非STEC菌均无交叉反应。整体检测时长可控制在1 h以内,冻干体系可在常温条件下保存1年以上。结论本方法快速、简便,适用于测定食品中的STEC。

通用引物多重PCR技术检测3种病原微生物

为寻找快速且准确的病原微生物检测方法,在普通多重PCR（polymerase chain reaction）技术的基础上研究一种新的通用引物多重PCR（universal primers-multiplex PCR,UP-M-PCR）技术。利用该技术对食品中主要的3种致病菌——大肠杆菌、单增李斯特菌和沙门氏菌进行同时检测,经过单重PCR验证、二重以及三重UP-PCR反应条件和体系优化。结果表明,该方法的最低检测限为0.5pg目标DNA,复合引物和通用引物的加入量分别为2nmol/L和300nmol/L。此方法检测灵敏度高、病原菌检测限低,可在实践中应用。

三种食源性致病菌多重PCR检测方法的建立

目的:建立同时快速检测沙门氏菌、志贺氏菌和肠出血性大肠杆菌O157∶H7的多重PCR方法。方法:根据沙门氏菌的invA基因、志贺氏菌的ipaH基因及肠出血性大肠杆菌O157∶H7的uidA基因设计3对引物,通过单因素实验、L9(34)正交实验优化反应体系,并对多重PCR扩增的敏感性进行分析。结果:3对引物能特异性扩增出495、620、252bp的目的片段;在最优多重PCR反应体系下,多重PCR检测3种致病菌的灵敏度达104CFU/mL;将该法应用于人工污染实验,可在5h内得到准确、稳定的检测结果。结论:该方法操作简单、检测特异性和灵敏度较高,能够实现对沙门氏菌、志贺氏菌和肠出血性大肠杆菌O157∶H7 3种食源性致病菌的快速监控和诊断。

几种常见肠道致病菌多重PCR检测的效果评价

目的:建立一种应用多重PCR技术,能够同时快速准确检测大肠杆菌O157、副溶血性弧菌、普通变形杆菌和单核细胞增生李斯特菌4种常见肠道致病菌的方法。方法:根据大肠杆菌O157、副溶血性弧菌、普通变形杆菌、单核细胞增生李斯特菌的特异基因作为目的基因,设计相应的引物,并进行实验优化以确立对4种肠道致病菌的检测体系。并对市售经果汁样品人工随机染菌后进行模拟样品验证。结果:该多重PCR方法能够有效地扩增出相应致病菌的目的基因片段,其中单核细胞增生李斯特菌扩增片段为155 bp,大肠杆菌O157扩增片段为366 bp,变形杆菌扩增片段为522 bp,副溶血弧菌扩增片段为199 bp,且特异性较强。对4种目标菌的检测灵敏度可达到103CFU.mL-1。能够检测出模拟样品中随机接种的任意3种细菌。结论:利用建立的多重PCR可以快速、准确地筛查大肠杆菌O157、副溶血弧菌、普通变形杆菌和单核细胞增生李斯特菌。

多重PCR快速检测3种致泻性大肠埃希菌方法的建立

目的利用多重聚合酶链反应(PCR)技术,建立一种可以同时快速检测肠致病性大肠埃希菌(EPEC)、肠侵袭性大肠埃希菌(EIEC)、肠出血性大肠埃希菌(EHEC)3种致泻性大肠埃希菌的多重PCR方法。方法根据EPEC的eae基因、EIEC的ipaH基因、EHEC的stx1基因筛选设计引物,建立多重PCR检测体系,并对PCR反应体系和条件进行优化。结果设计的3对PCR引物均能特异地扩增出相应的目的基因,该多重PCR体系能同时检测3种目的菌,特异度强。结论初步建立了一种能够同时快速检测3种致泻性大肠埃希菌的多重PCR检测方法,可用于食品安全及食物中毒事件的快速筛查。

大肠埃希菌产质粒介导AmpC酶的基因型检测

目的了解大肠埃希菌产质粒介导AmpC酶的现状及其基因型。方法收集任一第三代头孢菌素和头孢西丁耐药的大肠埃希菌临床分离株42株,以改良三维试验检测超广谱β-内酰胺酶(ES-BLs)和AmpC酶,用碱裂解法提取质粒,应用多重聚合酶链反应(multiplexpolymerasechainreaction,MPCR)对AmpC酶的基因进行检测,对PCR扩增阳性的样本进行基因测序以确定基因型。结果42株大肠埃希菌中,经三维试验检测,单纯产ESBLs者18株(42.8%),单纯产质粒AmpC酶者4株(9.5%),同时产质粒AmpC酶与ESBLs者1株(2.3%),5株AmpC酶三维试验阳性菌株,经PCR扩增其中4株扩增到了清晰的条带,1株扩增为阴性,PCR产物经测序分析其基因型均为DHA-1型。结论大肠埃希菌临床分离株产ESBLs率较高,并己经出现了质粒介导的AmpC酶,其基因型为DHA-1型。

食源性致泻大肠杆菌血清型及毒力基因的研究

了解浙江地区食源性致泻大肠杆菌的血清型分布特点及毒力基因携带状况。收集食品安全风险监测点的致泻大肠杆菌分离株,采用玻片凝集法对受试菌株进行血清分型,运用多重PCR检测其携带的毒力基因。在69株受试菌株中,优势血清型包括O148(16株)、O159(11株)、O6(4株)、O15(4株)、O63(4株)和O78(3株),这六种血清型菌株共计42株,占菌株总数的60.9%。菌株主要携带的毒力基因为ast A(42株)、est Ib(25株)、pic(15株)、esc V(14株)、aggR(14株);最常见的毒力基因组合为ast A+est Ib(25株)。进一步分析发现,携带ast A、est Ib基因的O148和O159的菌株对食品安全存在较大威胁。浙江地区食源性致泻大肠菌的类型以EAEC和ETEC为主,携带的主要毒力基因为ast A和est Ib,优势血清型为O148和O159。

多重PCR-DHPLC快速检测食品中产志贺毒素大肠杆菌

应用多重PCR(motiplex PCR)结合变性高效液相色谱技术(denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC)建立了快速检测食品中产志贺毒素大肠杆菌O111和O157的方法。以基因wzx O111、rfb EO157为靶基因,建立多重PCR-DHPLC方法,进行特异性和灵敏度测试,同时进行RT-PCR检测比较灵敏度。该方法具有良好特异性,可以一次PCR扩增同时检测O111、O157;灵敏度达到25 CFU/m L。129份牛肉样品中检出1例O111,3例O157阳性;74份鸡肉样品中检测出O111、O157阳性各1例,67份蔬菜样品中未检测到O111、O157。本文建立O111、O157多重PCR-DHPLC检测方法,操作简便,特异性强,适用于产志贺毒素大肠杆菌筛选检测。

食品中大肠埃希氏菌O121荧光PCR检测方法的研究

针对大肠埃希氏菌(Escherichia coli,E.coli)O121的O抗原基因簇的vio A基因的特异性序列设计引物和探针,通过对荧光聚合酶链式反应(real-time PCR)扩增条件的优化,建立检测E.coli O121的血清型特异性荧光PCR方法。E.coli O121标准菌株呈现扩增曲线,其它22株非O121 E.coli和19株非E.coli细菌的菌株均无扩增,检测的灵敏度可达155拷贝/反应。339份食品样品用EC肉汤增菌后用本荧光PCR法进行检测,检出E.coli O121阳性9份,阳性率为2.7%,其中市场上采购获得的生猪肉和生牛肉阳性率达4.1%。上述试验结果表明,本方法特异性强、操作简便,食品中E.coli O121检测全过程可在1.5 d内完成,适用于食品中E.coli O121的快速检测。

GeXP多重聚合酶链式反应法检测5种常见食源性致病菌

目的建立一种基于GeXP(GenomeLabTM eXpress Profiling)遗传分析系统的5种常见食源性致病菌检测的新技术。方法针对5种常见食源性致病菌(沙门菌、大肠埃希菌O157∶H7、单核细胞增生李斯特菌、志贺菌和副溶血性弧菌)分别进行基因序列比对(invA、rfbE、PfrA、IpaH、tlh基因),设计特异性引物,建立并优化GeXP多重聚合酶链式反应(PCR)体系,评价其特异性和灵敏性,并初步应用于未知菌株和人工污染样品的检测。结果GeXP多重PCR法可实现在5 h内同时对5种常见食源性致病菌进行检测,且检测灵敏度可低至103 CFU/mL。多重体系中各引物对各目标菌有较强特异性,未检出其他非目标菌。结论本方法可有效提高检测效率,为食源性致病菌的快速高通量检测提供了参考思路。

弥散黏附性大肠埃希菌多重PCR检测方法的建立及其在感染性腹泻患者中的流行情况

目的建立一种快速检测弥散黏附性大肠埃希菌(DAEC)的普通多重PCR方法,了解DAEC在腹泻患者中的流行情况。方法根据DAEC黏附基因afa B、afa C、afa D、daa E及16S rRNA基因rrs,建立4重PCR反应体系,对PCR引物、反应体系和反应条件进行优化,评价敏感性和特异性,并应用于389份腹泻患者粪便标本的筛查。结果 4重PCR反应可以特异性扩增DAEC菌株afa B/C、afa D、daa E基因片段,除2株肠集聚性大肠埃希菌(EAEC)外,检测引物对其他致泻性大肠埃希菌及常见肠道病原菌均无特异性扩增,此多重PCR方法的检测下限可达3.20×101CFU/反应(8.01×103CFU/ml)。利用本研究建立的多重PCR方法对腹泻患者粪便标本进行检测,发现DAEC菌株分离率为6.2%(24/389)。结论本研究建立的多重PCR方法可用于DAEC菌株的快速鉴别,也可用于人粪便标本DAEC的初步筛查。

食源性相关腹泻患者粪致泻性大肠埃希菌检测方法分析

目的了解分子生物学技术结合传统培养分离血清学鉴定方法检测食源性相关腹泻患者粪致泻性大肠埃希菌(DEC)的检测能力与可能的对应关系。方法比较多重荧光PCR技术与增菌培养分离鉴定法对200例食源性相关腹泻患者(均检出病原菌)粪DEC的检测,在培养鉴定中使用血清学凝集方法与VITEK 2 Compact全自动微生物分析系统生化鉴定方法。结果多重荧光PCR的DEC检出率为5.00%(10/200);而增菌培养分离血清学鉴定方法的DEC检出率为3.00%(6/200),有4例多重荧光PCR检测为阳性而血清学凝集方法未能检出经生化鉴定仍为大肠埃希菌;DEC对临床常用的抗生素有不同程度的耐药率。结论多重荧光PCR技术比较适合于食源性相关腹泻患者粪DEC的快速检测,弥补血清学凝集方法的不足,也应重视培养分离法对鉴定与药敏的地位。

产质粒介导AmpC酶大肠埃希菌中整合子的检测

目的探讨大肠埃希菌产质粒介导AmpC酶对抗生素的耐药情况,以及整合子的存在状况,为临床合理用药提供依据。方法收集河南省人民医院临床分离大肠埃希菌,对头孢西丁耐药株以酶提取物改良三维试验筛选高产AmpC酶株;多重PCR和DNA测序分析质粒AmpC基因型;用PCR-限制片段长度多态性(RFLP)初筛整合子并分型,PCR扩增整合子的可变区并测序。结果 126株大肠埃希菌中,检出产质粒介导AmpC酶14株(26.9%),对筛出的耐药菌株采用琼脂对倍稀释法检测耐药性;多重PCR扩增分析示:其基因型均为CMY-2型。8株耐药菌株检出1类整合子,序列分析显示存在aadA4、aadA5、aadB、cm lA、cm lA1、和dfr17基因盒,它们分别介导对氨基糖苷类抗生素、氯霉素和甲氧苄明的耐药。结论治疗产质粒介导AmpC酶的细菌感染时,应以第四代头孢菌素和碳青霉烯类抗生素为首选。我院大肠埃希菌临床分离株产质粒介导AmpC率较高,其基因型为CMY-2型,而相关耐药基因盒并未位于整合子上。

肠出血性大肠埃希菌(O_(157)∶H_7)的基因同源性的分析

目的 对江苏省徐州地区O157∶H7的病原学进行分析。方法 采用聚合酶链反应对O157∶H7菌株毒力基因谱进行检测 ,同时用脉冲凝胶电泳 (PFGE)和随机扩增多态性DNA(RAPD)方法对O157∶H7菌株的同源性分析比较。结果 流行地区分离的O157∶H7菌株 ,10 0 %携带Hly、eaeA基因 ,95 .35 %携带SLT2 基因 ,11.6 3%携带SLT1基因。脉冲凝胶电泳图谱表明流行地区分离的O157∶H7菌株与日本分离的O157∶H7菌株有明显差异 ,为不相关菌株 ;与国内标准菌株 882 36 4为近似型(相似 ,但不相同 )。流行地区患者分离菌株与外环境家畜家禽粪便及昆虫肠道分离菌株的脉冲凝胶电泳图谱完全相同。结论 携带O157∶H7菌株的家畜家禽可能是导致疫情发生的传染源。脉冲凝胶电泳方法用于O157∶H7病原学分析 ,对流行病学研究有重要意义。随机扩增多态性DNA方法用于O157∶H7病原学分析 ,技术简便、省时。

多重实时定量PCR同时检测人全血中大肠杆菌与白念珠菌基因方法的建立

目的建立多重实时定量PCR（MRQ—PCR）同时快速检测血中大肠杆菌与白念珠菌DNA的方法，以评估肠屏障损伤可能导致的移位微生物的种类和程度并提供针对性用药的建议。方法选择大肠杆菌β-右旋半乳糖苷酶基因作为检测大肠杆菌的靶基因设计引物和探针，选择白念珠菌ITS2基因设计引物和探针。采用QIAamp DNA Blood Mini Kit试剂盒提取大肠杆菌与白念珠菌基因组DNA；建立25μlTaqMan探针MRQ-PCR反应体系；对18份模拟血标本及10份外科发热患者临床标本进行MRQ—PCR检测。结果引物和探针特异性好，大肠杆菌与白念珠菌标准曲线相关系数分别在0．994—0．999和0．994～0．998，扩增效率分别为0．894～1．022和0．905～1．028。标准样品检测限分别为大肠杆菌13．9拷贝／μl和白念珠菌0．8cfu／μl，两种菌的检测灵敏度分别为100％和99．69％，特异度分别为100％和94．73％，标准品中大肠杆菌与白念珠菌特异基因平均回收率分别为（101．89±5．69）％和（103．74±4．64）％，两种菌基因检测的批内变异系数分别为（13．14±10．27）％和（19．18±8．54）％，批间变异系数分别为（14．35±9．34）％和（18．31±10．25）％。全血标本中大肠杆菌与白念珠菌特异基因的检出限分别为12455．2拷贝／ml和800．3cfu／ml，平均回收率分别为（111．60±11．06）％和（99．96±6．16）％，两种菌基因检测的批内变异系数分别为（11．02±5．65）％和（8．14±7．29）％，平均批间变异系数分别为（12．88±7．59）％和（18．62±9．14）％。结论多重实时定量PCR可以同时快速、灵敏、特异地定量检测人全血标本中大肠杆菌与白念珠菌基因，准确度高、重复性好、节省血标本用量及检测成本、总检测时间缩短，在临床全血标本的真菌与细菌快速鉴别检测、抗微生物药物的针对性应用及疗效评估、肠屏障损伤后果及疗效的评估中有较实用的推广前景。

Taqman探针荧光PCR法检测食品中的大肠埃希氏菌O145

针对大肠埃希氏菌O145的O抗原基因簇的wck D基因的特异性序列设计引物和Taqman探针,建立检测大肠埃希氏菌O145的荧光PCR方法,对其灵敏度、特异性进行验证,并将其用于食品样品的检测。结果表明,本研究中的方法可实现对大肠埃希氏菌O145的特异性扩增,其它27株非O145大肠埃希氏菌和20株非大肠埃希氏菌细菌的菌株均无扩增;检测的灵敏度可达165拷贝/反应;339份食品样品EC肉汤增菌后用本荧光PCR法进行检测,检出大肠埃希氏菌O145阳性31份,阳性率为9.1%。实验结果表明,本研究成功建立了可用于食品中大肠埃希氏菌O145的Taqman探针荧光PCR方法,食品样品采用EC肉汤增菌24 h、热裂解法提取核酸,增菌后检测所需时间由至少3 d^7 d缩短为仅需2 h^3 h,食品检测全过程仅需约28 h,经证实本方法特异性强、操作简便,为食品中大肠埃希氏菌O145提供了一种的快速检测手段。