生鲜乳中16种致病微生物多重荧光定量PCR集成检测技术的建立与初步应用

为满足生鲜乳中微生物快速通量检测的需求,建立多重荧光定量PCR集成方法,从而快速检测生鲜乳中潜在的16种致病微生物,通过设计致病性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌等目标菌株的特异性引物和探针,优化反应体系,验证方法的特异性、敏感性等,建立了稳定的4组多重集成荧光定量PCR反应体系,并利用人工污染的生鲜乳样品对所建立的方法和传统培养法进行了验证比较。结果显示:各对引物探针对目标菌株均能有效识别并扩增,每组体系中引物探针未发现交叉反应,对其余3组体系的12株非目标菌均未有特异性反应;组内和组间变异系数均低于3%;该方法对布鲁氏菌的最低检出限为10^(2) CFU/mL,对阪崎肠杆菌、志贺菌、沙门菌等7种致病微生物的最低检出限为10^(3) CFU/mL,对蜡样芽胞杆菌、弯曲杆菌、结核分枝杆菌等8种致病微生物的最低检出限为10^(4) CFU/mL;所建方法和传统培养法对人工污染不同致病菌的各25份样品检测结果基本一致。结果表明,本研究建立的多重集成荧光定量PCR方法灵敏度高,特异性及重复性好,可实现对生鲜乳样品中多种致病微生物的快速高效检测,为生鲜乳微生物性风险监测提供了技术支撑。