Concurrent pulmonary Mycobacterium avium complex (MAC) infection and active Hürthle cell thyroid carcinoma: is there a connection?

We present two cases of pulmonary MAC infection in women with Hürthle cell thyroid carcinoma. Both cases were asymptomatic octogenarian women with active Hürthle cell thyroid carcinoma and prolonged periods of hypothyroidism prior to diagnosis of pulmonary MAC. Mycobacterium avium complex has never been reported in association with any type of thyroid cancer, specifically Hürthle cell carcinoma. A review of the literature and possible associations between the two are discussed in this article.

江门市新会区高二学生潜伏性结核筛查结果感染现状调查和危险因素分析

目的:了解江门市新会区高中学生潜伏性结核(LTBI)的感染情况及相关危险因素,为新会区教育部门在学校开展结核病的筛查和预防工作提供理论依据。方法:对2021年9月至2022年1月江门市新会区在读的高中二年级学生开展结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测(IGRA)及问卷调查,对所有IGRA阳性学生进行结核菌素试验和X光胸片检查排除活动性肺结核;对IGRA阳性组与阴性组进行比较分析,采用多因素logistic回归分析与LTBI发生相关的危险因素。结果:共有9496人接受IGRA检测,LTBI阳性率2.65%(252/9496)。多因素logistic回归分析显示,糖尿病史(OR=8.634,P<0.05)、结核密切接触史(OR=1.684,P<0.05)、职业类高中(OR=1.357,P<0.05)的学生人群均为LTBI发生的危险因素。结论:江门市新会区高二学生LTBI感染率较高,教育部门应加强职业类高中学生、肺结核患者的接触者和患糖尿病学生的筛查,通过主动方式更早、更多发现学生肺结核患者。

巨噬细胞糖代谢重编程在结核分枝杆菌感染中的研究进展

巨噬细胞是参与先天性免疫的重要细胞,也是结核分枝杆菌感染的主要目标。研究发现,免疫细胞代谢重编程与其功能密切相关。在感染的早期阶段,巨噬细胞以M1极化为主,糖代谢方式从线粒体氧化磷酸化转变为有氧糖酵解(Warburg效应),促进炎性因子的分泌;在感染后期,巨噬细胞从有氧糖酵解转变为线粒体氧化磷酸化,从而抑制巨噬细胞促炎和抗菌反应。全面认识结核分枝杆菌感染期间巨噬细胞代谢与功能的关系有助于宿主导向疗法的发展。本文中,笔者对结核分枝杆菌感染期间巨噬细胞糖代谢重编程的相关研究进行了总结,以期为结核病的防治提供新思路。

结核病DNA疫苗pVAX1/ESAT-6的构建、鉴定及免疫效应评价

目的构建结核病DNA疫苗pVAX1/ESAT-6并探讨其诱导的免疫效应。方法将扩增自结核杆菌基因组的ESAT-6基因装入pVAX1载体构建pVAX1/ESAT-6重组质粒;经酶切、测序鉴定后,利用阳离子聚合物介导将重组质粒pVAX1/ESAT-6转染Hela细胞,分别以RT-PCR法检测ESAT-6 mRNA的表达、间接免疫荧光法检测ESAT-6蛋白表达。重组质粒经体内电转染免疫小鼠后,采用ELISA法测定小鼠血清中IFN-γ及抗ESAT-6特异性抗体IgG的水平;流式细胞术检测小鼠淋巴细胞增殖水平;ELISPOT检测产生IFN-γ的淋巴细胞频数。结果构建的重组质粒pVAX1/ESAT-6经双酶切于3000 bp和300 bp处各见1条带,测序结果显示插入序列与ESAT-6基因序列无差异。重组质粒转染Hela细胞后,RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳于约300 bp处见目的条带,间接免疫荧光检测显示特异性绿色荧光。重组质粒免疫小鼠后,血清中抗ESAT-6特异性抗体IgG水平较对照组(空质粒组和生理盐水对照组)明显升高;血清中IFN-γ水平、小鼠脾淋巴细胞增殖水平及产生IFN-γ的淋巴细胞数明显均高于对照组(空质粒组和生理盐水对照组)。结论成功构建了结核病DNA疫苗pVAX1/ESAT-6,该疫苗可有效诱导小鼠产生特异性细胞免疫和体液免疫效应。

母牛分枝杆菌感染引起小鼠细胞免疫应答的特征分析

为研究母牛分枝杆菌感染鼠的细胞免疫应答变化,本研究将母牛分枝杆菌分离株感染C57BL/6J小鼠,通过病理组织学检查肝脏的病理变化,并采用荧光定量PCR检测肝脏中细胞因子IFN-γ、IL-12b、TNF-α、IL-10、NLRP3和TGF-β表达量的变化。结果发现,肝脏组织出现明显的炎性细胞浸润,而且实验组小鼠肝脏IFN-γ、IL-12b、TNF-α的表达量显著高于对照组,IL-10和TGF-β仅有微弱的表达。上述结果表明,抗母牛分枝杆菌感染免疫反应主要以Th1免疫反应为主。本研究为母牛分枝杆菌免疫机制研究提供实验依据。

结核分枝杆菌抗原Rv2654重组蛋白的表达和纯化及其诱导的免疫应答特征

目的:随着卡介苗的保护效应日趋减弱,以及结核分枝杆菌耐药株的广泛存在,全球尚缺乏控制结核病的有效疫苗,全球结核病发病率和病死率仍然较高。本研究旨在分析结核分枝杆菌抗原Rv2654重组蛋白在诱导小鼠细胞免疫和体液免疫应答中的作用,评价其作为抗结核病候选疫苗的潜力。方法:在细菌的对数生长期加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactoside,IPTG)诱导细菌表达Rv2654重组蛋白,用亲和层析纯化,蛋白质印迹法鉴定Rv2654重组蛋白。采用ELISA方法检测不同人群血清与Rv2654重组蛋白的免疫反应性。以Rv2654重组蛋白免疫昆明小鼠,采用细胞因子磁珠阵列法检测小鼠外周血Th1/Th2类细胞因子水平,并以流式细胞术分析小鼠脾T、B淋巴细胞亚群分布。结果:成功表达Rv2654重组蛋白,以Rv2654重组蛋白作为抗原的ELISA结果显示其与卡介苗接种者或活动期结核患者血清均有反应性。Rv2654重组蛋白免疫小鼠可促进小鼠外周血IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6和IL-10等多种细胞因子表达(均P<0.05),流式细胞术结果显示Rv2654重组蛋白可显著刺激CD4+T细胞和CD8+T细胞分化为效应T细胞,这种作用在联合卡介苗应用时更为明显,Rv2654重组蛋白也能刺激小鼠B细胞活化增殖并向记忆细胞分化。结论:Rv2654重组蛋白可诱导小鼠的细胞免疫应答,而且与卡介苗接种者和活动性肺结核患者血清有较好的结合能力,有望作为结核病免疫学预防和诊断类疫苗的候选抗原。

GLS和IL-12偶联重组耻垢分枝杆菌免疫效果的观察

目的:研究携带编码人天然颗粒溶素(GLS)和小鼠IL-12基因质粒(pZM03)偶联重组耻垢分枝杆菌(ATCC607)经鼻黏膜免疫小鼠后,小鼠体内的免疫状况。方法:BALB/c小鼠36只,随机分为生理盐水、pZM03、ATCC607、卡介苗(BCG)、重组ATCC607(即携带pZM03的ATCC607)、灭活重组ATCC607组;采用滴鼻法免疫小鼠,BCG组0、14天各1次,其它组0、4、14天各1次,第0天免疫后4周处死小鼠,用ELISA检测血清中IFN-γ、IL-12、IgG2a、lL-4的分泌水平和淋巴细胞PPD诱导的IFN-γ分泌水平以及肺泡灌洗液特异性SIgA的水平,用MTS法检测免疫小鼠脾淋巴细胞增殖情况。结果:重组ATCC607血清中IFN-γ、IL-12水平与BCG组无明显差异但明显高于其他组(P<0.05),IgG2a水平重组ATCC607组高于BCG组和其他组(P<0.05),各组间IL-4水平差异无统计学意义。重组ATCC607、BCG、灭活重组ATCC607及ATCC607组用PPD均可诱导小鼠脾淋巴细胞增殖,各组间差异无显著意义,但与生理盐水和pZM03组间差异有显著意义(P<0.05)。重组ATCC607组PPD诱导淋巴细胞IFN-γ明显高于其它组(P<0.05),与BCG组比较无显著差异。重组ATCC607等含菌组经鼻黏膜免疫可产生黏膜特异性SIgA。结论:重组ATCC607经鼻黏膜免疫小鼠后,机体特异性免疫特别是细胞免疫和黏膜免疫增强,为重组ATCC607治疗结核病的研究奠定了基础。

固有免疫细胞对结核分枝杆菌的免疫识别

由结核分枝杆菌感染引起的肺结核已成为非常重要的健康问题，全球每年因结核病死亡的患者超过200万例。机体的固有免疫在抵抗结核分枝杆菌感染过程中发挥了重要作用。多种模式识别受体参与了固有免疫细胞对结核分枝杆菌的识别，包括Toll样受体（TLR）、C-型凝集素受体及核苷酸结合寡聚化结构域（NOD）样受体。在Toll样受体中，TLR2、TLR4及TLR9及其接头分子髓样分化因子（MyD88）在启动针对结核分枝杆菌感染的免疫应答方面发挥了主要作用。另外，其他的模式识别受体，如NOD2、树突状细胞相关性C型植物血凝素-1（Dectin-1）、甘露糖受体及树突状细胞表面特异性C型凝集素-细胞间黏附分子3结合非整合素分子（DC-SIGN）也参与对结核分枝杆菌的识别。流行病学研究发现，模式识别受体基因突变影响机体对结核分枝杆菌感染的易感性。因此，深入研究模式识别受体对结核分枝杆菌的识别特点及基因多态性分布特征，对加深了解结核分枝杆菌致病特点、设计新型抗结核的免疫制剂可提供理论支持。

肺结核患者血清白细胞介素-12水平检测及临床意义

目的了解白细胞介素(IL)-12在肺结核病中的临床意义。方法对80例抗结核治疗前肺结核患者血清IL-12,采用酶联免疫法进行检测,并与30例健康志愿者(健康对照组)、20例有效抗结核治疗随访6个月后的患者进行对比,同时依据临床常用结核检测指标分组研究IL-12的临床意义。结果 80例肺结核患者血清IL-12均值为(41.49±34.22)pg/mL,显著低于健康对照组(58.12±44.92)pg/mL,差异有统计学意义(t=2.51,P<0.05)。20例随访肺结核患者经6个月有效抗结核治疗后,血清IL-12水平由治疗前的(12.93±12.48)pg/mL上升为(66.26±20.97)pg/mL,差异有统计学意义(t=-6.88,P<0.05)。20例随访肺结核患者经6个月有效抗结核治疗后,血清IL-12水平与健康对照组比较,差异无统计学意义(t=-0.60,P>0.05)。肺结核患者血清IL-12水平在不同分组中:单纯肺结核/肺结核合并结核性胸膜炎组、空洞组/非空洞组、肺CT病变累及<3叶组/≥3叶组、痰结核菌阳性组/阴性组、结核试验阳性组/阴性组、血沉升高组/正常组、PPD强阳性组/非强阳性组,差异均无统计学意义(均P>0.05)。结论 IL-12与肺结核活动性密切相关,其水平可作为临床工作中了解患者免疫状态,判断肺结核活动性和病情转归的临床参考指标。

母牛分枝杆菌菌苗对无症状期HIV感染者CD4^+和CD8^+T细胞计数及病毒载量的影响

目的探讨母牛分枝杆菌菌苗对无症状期HIV感染者CD4+和CD8+T细胞计数及病毒载量的影响。方法以无症状期HIV感染者为研究对象,随机分为治疗组Ⅰ、Ⅱ和对照组Ⅰ、Ⅱ,治疗组予肌肉注射母牛分枝杆菌菌苗,比较分析4组患者治疗2个月后CD4+和CD8+T细胞计数及病毒载量的变化。结果治疗组Ⅰ、Ⅱ的CD4+、CD4+/CD8+治疗后明显高于治疗前和对照组Ⅰ、Ⅱ,差异有统计学意义(P<0.05),但病毒载量无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05),而对照组的CD4+、CD4+/CD8+细胞计数及病毒载量治疗前后比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论母牛分枝杆菌菌苗对无症状期HIV感染者能增强细胞免疫功能但对HIV病毒载量无明显影响。

结核分枝杆菌新型抗原Rv3117联合DDA/MPL佐剂作为亚单位疫苗在小鼠体内的免疫评估

目的用结核分枝杆菌(M.tuberculosis)特异性抗原Rv3117联合双十八烷基二甲基溴化铵(DDA)/单磷酰脂质体A(MPL)佐剂构建结核亚单位疫苗(Rv3117/DDA/MPL),并在C57BL/6小鼠体内评估其加强卡介苗(BCG)首次免疫后的免疫效应。方法采用分子克隆方法构建重组质粒p ET32a-Rv3117,转入感受态大肠埃希菌BL21(DE3)PLys S,诱导表达并纯化目的蛋白,用Triton X-114相分离法去除目的蛋白中的内毒素,然后与DDA/MPL佐剂充分乳化构建亚单位疫苗。C57BL/6小鼠随机分为对照组(未予任何处理)、PBS组(免疫PBS)、BCG组(单纯首次免疫BCG)、BCG+DDA/MPL组(首次免疫BCG,2周后用佐剂DDA/MPL加强免疫2次)和BCG+Rv3117/DDA/MPL组(首次免疫BCG后用亚单位疫苗Rv3117加强免疫2次),每组5只。分别采用酶联免疫斑点检测(ELISPOT)和酶联免疫吸附测定(ELISA)技术对免疫小鼠的细胞免疫和体液免疫进行评估。结果成功克隆表达并纯化结核特异性抗原Rv3117。ELISPOT和ELISA结果显示:受10.0μg/m L结核菌素纯化衍生蛋白(PPD)刺激后,与对照组、PBS组、BCG组和BCG+DDA/MPL组比较,BCG+Rv3117/DDA/MPL组小鼠T细胞产生γ干扰素(IFN-γ)的水平明显升高(P<0.05);BCG+DDA/MPL组培养上清液中肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素6(IL-6)、白介素12(IL-12p70)细胞因子水平均显著高于对照组和PBS组(P<0.05),总抗体Ig G和Ig G1亚型水平亦较高;而BCG+Rv3117/DDA/MPL组上述指标水平均显著优于BCG+DDA/MPL组(P<0.05)。结论亚单位疫苗Rv3117/DDA/MPL在C57BL/6小鼠体内可增强BCG的细胞免疫和体液免疫效应。结核分枝杆菌特异性抗原Rv3117有望成为新的结核疫苗设计及结核诊断的候选抗原。

结核杆菌磷酸烯醇型丙酮酸羧基酶诱导小鼠细胞和体液免疫应答

目的检测结核杆菌磷酸烯醇型丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase,PEPCK)对BALB/c小鼠的免疫保护作用。方法选清洁级BALB/c小鼠60只,随机分为两组,实验组和对照组。实验组每只小鼠用表达的PEPCK融合蛋白10μg加弗氏不完全佐剂进行腹腔免疫注射,对照组小鼠仅用弗氏不完全佐剂注射。每隔2w免疫1次,共免疫3次。末次免疫2w后,分别取小鼠脾脏、血清,流式细胞仪检测CD4+和CD8+T细胞,MTT法检测淋巴细胞对刺激的应答水平,ELISA检测血清各种细胞因子及抗PEPCK抗体。结果实验组小鼠的脾脏明显大于对照组小鼠的脾脏,且粘连严重,CD4+T细胞增殖明显(73.5±3.69),CD4+/CD8+比值显著升高(5.1±0.98)(P<0.01);且淋巴细胞的应答能力明显强于对照组小鼠;实验组小鼠血清中IFN-γ、IL-12和TNF-α明显高于对照组,血清抗体滴度随免疫次数逐步增高。结论结核杆菌PEPCK能够有效的刺激机体产生细胞免疫反应和体液免疫反应,尤以细胞免疫反应为主,是很好的抗结核候选疫苗分子之一。

结核感染小鼠肺部病理变化与T细胞免疫关系的实验研究

目的探讨结核病小鼠肺部病理变化与T细胞亚群的关系。方法将60只C57BL小鼠随机分为3组,每组20只。结核病模型组小鼠经球后静脉丛注射人型结核分枝杆菌标准毒力珠(H37RV);免疫调节剂组结核病模型小鼠于H37RV感染后第3、10、17天分别肌注22.5μg母牛分枝杆菌菌苗(微卡菌苗);正常对照组小鼠未做处理。感染4周后,留取外周血用流式细胞仪测定T细胞亚群;取肺组织,采用常规苏木精-伊红染色和抗酸染色后病理切片观察病理变化。结果结核病模型组小鼠大部分肺组织实变,多数肺泡腔消失,肺泡隔重度增宽,肺间质内可见大量炎性细胞浸润,浸润细胞以中性粒细胞为主,淋巴细胞较少。残存的肺泡腔中有红细胞、纤维素渗出。肺实变区内分布大量的紫红色结核分枝杆菌,主要存在于单核-巨噬细胞胞质内。外周血T细胞亚群的相对比率明显减少。免疫调节剂组肺组织病变和结核病模型组大致相似,但实变病灶较少,多数肺泡腔存在,肺泡隔内浸润淋巴细胞较多,肺泡腔内有渗出单核-巨噬细胞。肺实变区内结核分枝杆菌明显少于结核病模型组,CD3+与CD4+T细胞比例增加,能显著增加γδT细胞比例。结论微卡菌苗可增强结核病小鼠的免疫功能,使肺实变病灶较少和病灶内结核分枝杆菌明显减少,肺泡腔内单核-巨噬细胞增多,为免疫调节剂辅助治疗结核病提供理论依据。

结核分枝杆菌Rv0315重组蛋白ELISPOT辅助诊断活动性肺结核的应用价值

目的用酶联免疫斑点试验(ELISPOT)评价结核分枝杆菌重组蛋白Rv0315在活动性肺结核病诊断中的应用价值。方法选取初治肺结核病患者25例和健康体检者28名分别作为结核组和对照组,应用Rv0315蛋白作为抗原对受试者外周血单核细胞进行ELISPOT检测斑点形成细胞(SFCs)的数量,判断结核分枝杆菌感染情况,并与结核早期分泌靶向抗原(ESAT6)和培养滤液蛋白10(CFP10)抗原的检测结果进行比较。结果以Rv0315、EAST6和CFP10作为抗原,用ELISPOT方法检测结核分枝杆菌感染的敏感度分别为84.0%(21/25)、80.0%(20/25)和92.0%(23/25),特异度分别为89.2%(25/28)、89.2%(25/28)和92.8%(26/28),其中Rv0315的敏感度高于EAST6但低于CFP10。结论应用重组蛋白Rv0315作为抗原建立的ELISPOT方法具有应用于活动性肺结核病辅助诊断的潜在价值。

结核菌H37Ra在小鼠体内诱导的抗结核细胞免疫应答的研究

目的:研究结核菌H37Ra免疫小鼠后产生的特异性细胞免疫应答及其对结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)毒株感染的保护力。方法:Balb/c小鼠随机分为H37Ra组、BCG组和生理盐水(NS)组,皮内免疫8周后处死小鼠,流式细胞分析仪检测小鼠脾脏T淋巴细胞亚群的变化;取小鼠脾淋巴细胞体外培养并用PPD刺激,MTT法检测脾淋巴细胞的刺激指数(SI);ELISA法检测培养上清液中IFN-γ;免疫后第8周,用MTB毒株H37Rv经小鼠腹腔注射,4周后处死小鼠,测定小鼠肺脏荷菌量,观察免疫小鼠对MTB抵抗作用。结果:H37Ra免疫小鼠脾脏CD3^+T细胞、CD4^+T细胞的百分率分别为(41.63±1.68)%、(27.08±0.58)%,显著高于NS对照组(38.34±0.74)%、(24.37±1.60)%(P<0.05)。H37Ra免疫组脾脏CD3^+T细胞、CD4^+T细胞及CD8^+T细胞的百分率均不同程度地高于BCG免疫组,但差异无统计学意义。脾淋巴细胞SI和IFN-γ水平检测均发现H37Ra免疫组显著高于NS对照组(P<0.05),略高于BCG免疫组。感染4周后H37Ra组小鼠肺脏荷菌量与NS对照组比较下降0.954log_(10)CFU,差异有显著性(P<0.05),与BCG组之间差异均无显著性(P>0.05)。结论:H37Ra免疫小鼠后可以诱导产生特异性抗结核的细胞免疫应答,能够抵抗毒株H37Rv的攻击,且免疫效果与BCG相近。

草分枝杆菌联合顺铂治疗恶性胸腔积液的临床评价

目的 :观察草分枝杆菌胸腔内注射治疗恶性胸腔积液的近期疗效、毒副反应及其对患者T淋巴细胞亚群水平的影响。方法 :将 6 2例恶性胸腔积液患者随机分成试验组和对照组 ,先尽量排完胸腔积液 ,试验组向胸腔内注射生理盐水 2 0ml +草分枝杆菌 8.6 μg+顺铂 4 0mg ;对照组向胸腔内注射生理盐水 2 0ml +顺铂 4 0mg ,每周 1次 ,连续 1～ 3次 ,1mon后观察疗效及治疗前后T淋巴细胞亚群水平变化。结果 :试验组总有效率为 87.5 % ,高于对照组 (P <0 .0 1) ,毒副反应少而轻微。治疗后CD+3 、CD+4及CD+4 CD+8明显升高 (P <0 .0 1或 0 .0 5 ) ,CD+8显著降低 (P <0 .0 1)。结论 :草分枝杆菌联合顺铂治疗恶性胸腔积液疗效肯定 ,副反应少 ,且能明显改善患者T淋巴细胞亚群抑制状态。

树突状细胞在结核分枝杆菌感染中作用的研究进展

树突状细胞(DC)作为最有效的抗原呈递细胞(APC),在结核分枝杆菌(MTB)感染中的作用机制日益受到重视。机体感染MTB后,DC能够有效摄取加工抗原、分泌多种细胞因子、激活免疫应答,在机体的抗结核免疫中发挥重要作用。该文详细介绍MTB感染后DC表面分子的变化、定向迁移及诱导免疫耐受的机制等方面的研究进展。

结核分枝杆菌海藻糖磷酸磷酸酶诱导小鼠体液和细胞免疫应答

目的 研究结核分枝杆菌（M．tuberculosis）海藻糖磷酸磷酸酶（TPP）诱导小鼠体液和细胞免疫。方法 差速离心分离结核分枝杆菌H37Rv和卡介苗（BCG）的各细胞组分，通过Western杂交检测抗原TPP在结核分枝杆菌H37Rv和BCG中的亚细胞定位情况。分别用5×10^6 CFU的BCG和50μg的TPP蛋白免疫C57BL／6小鼠，检测小鼠血清中抗TPP的IgG1和IgG2a抗体效价。取免疫小鼠的脾细胞，体外抗原刺激，用酶联免疫斑点试验（ELISPOT）检测γ干扰素（IFN-γ）分泌细胞。结果 TPP亚细胞定位于结核分枝杆菌H37Rv和BCG的胞壁和细胞膜组分。TPP蛋白免疫后小鼠产生的TPP特异性IgG1和IgG2a抗体效价明显高于BCG免疫小鼠，并且IgG2a的抗体效价高于IgG1。体外抗原刺激TPP蛋白和BCG免疫小鼠的脾细胞，都能诱导较高的IFN-γ分泌。结论 结核分枝杆菌细胞壁蛋白TPP能诱导小鼠Ⅰ型辅助性T细胞介导的免疫反应，可作为抗结核疫苗的候选抗原。

结核分枝杆菌新型抗原Rv3400的免疫原性研究

目的用结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）特异性抗原Rv3400联合弗氏不完全佐剂（incom-pleteFreund’s adjuvant，IFA）构建结核亚单位疫苗（Rv3400-IFA），在C57BL／6小鼠体内评估其免疫效应。体外用抗原Rv3400感染巨噬细胞RAW264．7并评估其免疫应答。方法PCR扩增基因Rv3400，构建重组质粒pET28a（＋）-Rv3400，转人大肠埃希菌BL21（DE3）pLysS感受态细胞中，诱导表达并纯化Rv3400蛋白。用抗原Rv3400、阳性对照脂多糖（1ipop01ysaccharides，LPS），分别刺激小鼠巨噬细胞RAw264．7，阴性对照为未刺激的巨噬细胞，流式细胞术检测细胞表面分子表达，收集细胞培养上清，ELISA检测细胞因子的分泌。另一方面纯化的Rv3400蛋白与IFA充分乳化构建亚单位疫苗免疫小鼠；C57BL／6小鼠采用数字表法随机分为3组，分别为实验组Rv3400组、阳性对照组Rv3425组、阴性对照组IFA组，每组5只，每2周1次、共免疫3次。分别采用酶联免疫斑点检测技术（enzyme-linkedimmunospotassay，ELISPOT）和酶联免疫吸附测定（ELISA）技术对免疫小鼠的细胞免疫和体液免疫进行评估。结果（1）成功克隆表达并纯化结核分枝杆菌特异性抗原Rv3400。（2）体外细胞实验结果显示：Rv3400抗原刺激巨噬细胞，其表面分子CD80、CD86、CD40、MHCII表达量显著提高，阳性细胞比率[分别由未刺激的（34．70±2．40）％、（31．25±18．31）％、（41．80±6．01）％、（44．30±0．44）％提高至1μg/mlRv3400抗原刺激后的（90．45±7．71）％、（90．10±4．10）％、（89．97±7．79）％、（85．13±5．12）％]；能促进细胞分泌高水平的肿瘤坏死因子（tumornecrosisfactor-a，TNF-a）和白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6），分别达（49217．0±390．61）pg／ml、（1783．4±51．18）pg／ml。（3）免疫小鼠后，ELISPOT结果显示：实验组Rv3400组小鼠分泌INF-7的斑点形成细胞（spotformingcells，SFC）（136．20士95．09）显著高于阴性对照组（14．00±9．62）（t=2．859，P〈0．01）；ELISA结果显示：Rv3400组小鼠T细胞产生TNF-α和IFN-7的水平[（247．38±142．268）pg／ml、（325．45±75．19）pg／m1）]明显高于阴性对照组[（69．25±60．06）pg／ml、（2．22±1．28）pg／ml（t=2．579，PG0．05；t=8．597，PG0．01）]；（4）Rv3400组小鼠脾CD4’CD44№“、CIN’CD62Llow、CD8＋CD44high、CD8＋CD62Llow T淋巴细胞百分比[（44．20±11．95）％，（43．56±11．90）％，（48．88±7．42）％，（47．04±7．72）％]与对照组IFA组[（27．02±6．56）％，（62．60±4．73）％，（30．57±6．00）％，（58．48±6．06）％]相比，差异有统计学意义（one-wayANOVA，F=18．460，F=8．108，F=32．194；F=4．080；P〈0．05，P〈0．01，P〈0．01，P〈0．05），呈显著性增加。（5）通过间接ELISA测定免疫后的小鼠血清抗体IgG效价水平高达1：409600，表明抗原Rv3400也能诱导有效的体液免疫应答；IgG2b／IgGl水平为1．8，说明抗原Rv3400诱导小鼠以Thl型免疫反应为主。结论亚单位疫苗Rv3400-IFA在C57BL／6小鼠体内可产生较好的细胞免疫和体液免疫效应。结核分枝杆菌特异性抗原Rv3400有望成为新的结核病疫苗设计及诊断的候选抗原。

结核分枝杆菌休眠相关抗原Rv1733c DNA疫苗的构建及免疫学特性研究

目的构建结核分枝杆菌(Mtb)休眠相关抗原Rv1733c的真核表达载体,并评价其作为DNA疫苗的免疫学特性。方法利用限制性酶切的方法从本室前期保存的pMD-18T-Rv1733c质粒中构建Rv1733c的真核表达载体pcDNA-Rv1733c。将pcDNA-Rv1733c重组质粒稳定转染P815细胞,并用间接免疫荧光法检测Rv1733c的表达。采用数字表法随机将BALB/c小鼠分为3组,每组10只,即pcDNA-Rv1733c质粒DNA组、生理盐水组和BCG组。pcDNA-Rv1733c质粒DNA组和生理盐水组采用肌内注射方式免疫,间隔2周免疫1次,共免疫3次。BCG组采用皮下免疫一次。各组小鼠每2周采血,ELISA检测血清中特异性抗体水平和IgG2a/IgG1抗体亚类比率与比值。初次免疫8周后,MTS[3-(4,5-diethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2Hetrazolium,inner salt](四氮唑蓝盐化合物)法检测小鼠脾淋巴细胞特异性增殖、ELISPOT检测脾淋巴细胞分泌IFN-γ的水平。流式细胞法检测脾淋巴细胞中CD4+和CD8+T细胞所占比率;LDH法检测CTL(cytotoxic T lymphocytes;细胞毒性T淋巴细胞)活性。结果成功构建Rv1733c的真核表达载体pcDNA-Rv1733c。间接免疫荧光实验表明pcDNA-Rv1733c质粒稳定转染的P815细胞中能够稳定表达Rv1733c蛋白。pcDNA-Rv1733c质粒DNA免疫小鼠后能诱导小鼠产生特异性抗体,抗体亚类以IgG2a为主,随着免疫时间的延长,IgG2a/IgG1的比值趋于平衡;脾淋巴细胞增殖指数(2.00±0.36)高于BCG组(1.1±0.06)(t=3.096,P<0.05);特异性分泌IFN-γ的脾淋巴细胞频数(41.48±5.30)SFC/106高于生理盐水组(2.75±1.37)SFC/106(t=4.752,P<0.05);然而脾淋巴细胞中CD4+、CD8+T细胞所占比率[分别为(18.15±2.30)%、(7.68±1.34)%]、CTL杀伤活性[(29.52±1.96)%]都与生理盐水组相当[(16.43±2.02)%(t=0.571,P>0.05)、(7.32±0.42)%(t=0.234,P>0.05)、(25.28±2.51)%(t=0.726,P>0.05)]。结论成功构建Rv1733c真核表达载体pcDNA-Rv1733c;并能够诱导小鼠机体产生特异性的体液和细胞免疫应答,提示用于结核病新型疫苗的研究具有一定的意义。