基因片段Myo5a原核表达、纯化及多克隆抗体制备

目的:制备了PGEX-4T-3/Myo5a原核表达载体,并表达与纯化融合蛋白,制备其多克隆抗体。方法:通过PCR扩增Myo5a末端一个基因小片段,Bam HⅠ和XhoⅠ双酶切后,连接到原核载体pGEX-4T-3,制备原核表达载体PGEX-4T-3/Myo5a。鉴定后,在BL21菌中诱导表达蛋白并对重组蛋白进行纯化,重组蛋白PGEX-4T-3/Myo5a采用聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹进行鉴定。采用融合蛋白免疫家兔,制备其抗血清,测定抗血清效价和特异性。结果:经鉴定后原核表达载体PGEX-4T-3/Myo5a制备成功,表达的重组蛋白相对分子量约为30 kD。免疫家兔后抗血清滴度为1∶128 000,免疫印迹和间接免疫荧光证明其特异性。结论:实验成功制备了PGEX-4T-3/Myo5a原核表达载体,融合蛋白具备了较高的免疫反应性,并得到了其多克隆抗体,为进一步探讨Myo5a的生物学意义做了铺垫。

鱼类Ⅲ型Myosin基因家族成员的表达和功能研究

Ⅲ型Myosin蛋白在哺乳动物的听觉毛细胞中发挥重要功能,其突变可导致内耳毛细胞功能异常,引起听力丧失,但在鱼类胚胎中的表达及功能仍不清楚。本研究以斑马鱼(Daniorerio)作为研究对象,研究了Ⅲ型Myosin基因家族成员myo3a及myo3b在斑马鱼早期胚胎中的表达及功能。整胚原位杂交结果显示:myo3a及myo3b在早期10体节前均无明显表达;在受精后24h胚胎中,myo3a基因的表达主要集中在脑部,并在端脑及间脑部位有强烈表达;而myo3b的表达主要集中在神经管腹部神经元细胞中。进一步双荧光原位杂交染色结果显示,myo3b主要在神经管腹部脑脊液接触神经元(CSF-cNs)中表达。此外,与人及小鼠类似,斑马鱼myo3a及myo3b基因在内耳中均有表达,暗示其功能在内耳发育中的保守性。为进一步研究其功能,本研究利用CRISPR/Cas9技术对myo3a和myo3b基因进行敲除,获得了相应的突变体。对突变体的初步研究表明,myo3a和myo3b的单独缺失对斑马鱼的内耳毛细胞以及神经管的发育均无显著影响,而双突变胚胎出现眼睛变小,鱼鳔不能形成以及毛细胞纤毛变短等表型,表明Ⅲ型Myosin基因家族在斑马鱼的胚胎发育中发挥一定的功能。

三项心肌标志物在各类型冠心病诊断中的应用及评价

目的了解3项心肌标志物对急性心肌梗死(AMI)、不稳定心绞痛(UAP)和稳定性心绞痛(SAP)的诊断价值,以资评估。方法心肌肌钙蛋白I(CTnI)和肌红蛋白(Myo)采用荧光抗原抗体法,心肌酶谱(MEP)采用速率法。对67例各类型冠心病(CHD)的血清中CTnI、Myo和"MEP"含量检测,并对结果加以比较和分析。结果 AMI 28例的3项指标异常检出率分别为78.57%、75.00%和85.71%;UAP 20例,异常检出率分别为45.00%、40.00%和20.00%;SAP 19例,3项指标的异常检出率分别为零、零和5.26%。若3项指标在AMI、UAP和SAP患者中异常检出结果各项各组之间互为交叉比较,结果除MEP诊断UAP与SAP结果差异无统计学意义外,其他各项各组结果比较,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论 3项心肌标志物各具有特点,对冠心病各类型均有早期诊断和鉴别诊断的意义。3项指标一起用于临床,对急性冠脉综合征(ACS)早期判断、预后、预测、危险分层、风险评估等具有诊断价值。