RNA结合蛋白ZFP36在心肌细胞缺氧/复氧损伤中的作用及调控机制

目的探讨RNA结合锌指蛋白36(ZFP36)在缺氧/复氧(H/R)诱导的心肌细胞损伤和自噬中的作用及分子调控机制。方法H9C2大鼠心肌细胞感染ZFP36过表达慢病毒(OE-ZFP36)或其阴性对照慢病毒(OE-ZFP36 NC)构建稳转细胞株;转染ATG4D过表达质粒(OE-ATG4D)提高ATG4D表达。H/R处理诱导心肌细胞损伤;将H9C2细胞分为对照组、H/R组、OE-ZFP36 NC+H/R组、OE-ZFP36+H/R组、OE-ATG4D NC+H/R组、OE-ATG4D+H/R组、OE-ZFP36+OE-ATG4D NC+H/R组和OE-ZFP36+OE-ATG4D+H/R组。各组细胞应用Western blotting检测ATG4D、Beclin1、LC3和ZFP36蛋白表达;实时荧光定量PCR(qPCR)检测ZFP36和ATG4D mRNA表达;CCK-8检测细胞活性;酶联免疫吸附法(ELISA)检测白介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子(TNF-α)水平;DCFH-DA法检测活性氧(ROS)水平;SOD试剂盒检测SOD水平;流式细胞术检测细胞凋亡;细胞免疫荧光检测LC3自噬体;双荧光素酶报告基因实验检测ZFP36和ATG4D mRNA的结合。结果与对照组比较,H/R组中细胞活性降低,IL-6和TNF-α水平提高,ROS水平升高而SOD水平降低,细胞凋亡增加;ATG4D、Beclin1蛋白表达上调,同时LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值也显著增加;且ZFP36表达上调(P<0.05)。与OE-ZFP36 NC+H/R组比较,OE-ZFP36+H/R组中细胞活性提高,IL-6和TNF-α水平降低,ROS水平下降而SOD水平升高,细胞凋亡减少,且ATG4D、Beclin1蛋白表达下调,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值也显著下调(P<0.05)。与感染OE-ZFP36 NC慢病毒比较,感染OE-ZFP36慢病毒降低ATG4D 3′-UTR报告基因的荧光素酶活性,降低ATG4D mRNA稳定性,下调H/R诱导的ATG4D mRNA表达(P<0.05)。与OE-ATG4D NC+H/R组相比,OE-ATG4D+H/R组中的ATG4D mRNA和蛋白表达显著上调,且细胞活性降低,IL-6和TNF-α水平增高,ROS水平升高而SOD水平降低,细胞凋亡增加(P<0.05)。与OE-ZFP36+OE-ATG4D NC+H/R组比较,OE-ZFP36+OE-ATG4D+H/R组中细胞活性降低,IL-6和TNF-α水平增高,ROS水平升高而SOD水平降低,细胞凋亡增加(P<0.05)。结论ZFP36在H/R诱导的心肌细胞损伤中表达上调,过表达ZFP36抑制了H/R诱导的心肌细胞损伤,并通过调控ATG4D抑制自噬,进而抵抗心肌细胞H/R损伤,证明ZFP36是抵抗心肌缺血再灌注损伤的重要调控分子。

线粒体自噬在心肌缺血/再灌注损伤中的作用研究进展

心肌缺血/再灌注损伤(MI/RI)时,可通过多种分子机制激活线粒体自噬。适度的线粒体自噬有助于维持线粒体膜电位,保护细胞膜结构和功能,从而减少MI/RI的发生。当线粒体功能出现紊乱,受损的线粒体不能充分清除或者线粒体自噬过度激活时,都会使MI/RI更严重。

参麦方对缺血心肌组织蛋白S-亚硝基化的影响

目的：观察参麦方对急性心肌缺血的保护作用及其对心肌蛋白S-亚硝基化的影响。方法：SD大鼠分为给药组与模型组，给药组灌胃参麦方（3g·kg^-1）5d后，结扎冠状动脉左前降支造成心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia／reperfusion injury，MI／RI）；测定血清肌酸激酶（CK）、乳酸脱氢酶（LDH）含量，以评价心肌损伤程度；Griess法测定血清一氧化氮（NO）含量，Western blot法检测心肌组织内皮型一氧化氮合酶（eNOS）表达变化；分别采用Biotin Switch法和DAN荧光法对心肌蛋白S-亚硝基化水平进行检测。结果：与模型组比较，参麦方给药组血清CK，LDH活性明显下降（P〈0．05），表明参麦方具有良好的抗心肌缺血效果。此外，血清NO含量显著升高且心肌组织eNOS表达上调（P〈0．01）。相对分子质量90～117×10^3的心肌蛋白发生明显的S-亚硝基化，其S-亚硝基化水平由（4．42±0．60）μmol·g^-1上升至（8．78±1．37）μmol·g^-1 （P〈0．01）。结论：促进缺血心肌组织蛋白的S-亚硝基修饰可能是参麦方抗心肌缺血再灌注损伤的主要作用途径之一。

抑制COX-2表达对心肌缺血再灌注损伤过程中心肌细胞保护作用的研究

目的研究心肌缺血再灌注损伤过程中,环氧化酶-2(COX-2)表达水平与心肌细胞损伤之间的分子机制。方法通过缺氧/复氧(H/R)实验,模拟心肌缺血再灌注过程,在H9C2心肌细胞系中检测COX-2及其相关蛋白的表达水平,并通过COX-2特异性抑制剂NS398抑制其活性,观察细胞变化情况,并研究其作用机制。结果NFκB的激活诱导COX-2表达上调,COX-2促进H/R介导的促炎症因子转录,以及ROS活性增强。结论心肌细胞受到H/R刺激时,NFκB的激活诱导COX-2表达上调,抑制COX-2活性能够降低H/R诱导的促炎症因子转录以及ROS活性增强,从而发挥对心肌细胞的保护作用。

抑制COX-2表达通过Akt/iNOS/NO信号通路发挥抗凋亡作用机制的研究

目的探讨心肌缺血/再灌注损伤过程中环氧化酶-2(COX-2)的表达水平与细胞凋亡之间联系及作用机制。方法通过对心肌细胞进行缺氧/复氧(H/R)实验,模拟心肌缺血再灌注过程,检测COX-2及凋亡相关蛋白的表达水平;采用COX-2特异性抑制剂NS398对其活性进行抑制,观察细胞凋亡水平的变化,并研究其作用机制。结果与对照组相比,在H/R组中,Bcl2表达明显减少,cleaved capase-3的表达明显增强;在NS398预处理后,cleaved caspase-3的表达明显减少,Bcl2表达增强,TUNEL试验结果提示,NS398预处理明显减少阳性细胞的比例。结论在心肌细胞中,H/R刺激能够激活COX-2表达,并通过促凋亡途径导致细胞损伤;抑制COX-2活性能够激活Akt/iNOS/NO信号通路,并进而通过抗凋亡机制,发挥对心肌细胞的保护作用。

白黎芦醇减轻Ⅱ型糖尿病小鼠心肌缺血/再灌注损伤的作用

目的:探讨白黎芦醇(RSV)减轻Ⅱ型糖尿病(T2DM)小鼠心肌缺血/再灌注损伤(MI/RI)的作用及其机制。方法:采用喂养高脂饮食结合小剂量链脲佐菌素(STZ)建立T2DM小鼠模型。造模成功后立即给予RSV(10 mg/kg)每日1次灌胃,连续3周。实验分为正常假手术组、正常手术对照组、DM假手术组、DM手术对照组、RSV组、CpC组,每组20只。手术方式采用心脏冠状动脉左前降支结扎30 min、再灌注3 h或24 h。抑制剂组于术前1 h腹腔注射Compound C(20 mg/kg)。用TTC染色法检测心肌梗死(MI)面积,TUNEL法检测心肌细胞凋亡,ELISA法检测caspase-3活性、血浆脂联素(APN)水平,Western blot法检测AMPK、p-AMPK及脂肪组织APN的含量。结果:喂养高脂饮食结合小剂量STZ能够成功建立T2DM小鼠模型。与DM手术对照组相比,RSV饲喂能够减轻T2DM小鼠MI/RI,减小MI面积、减少心肌细胞凋亡(P<0.01),降低caspase-3的活性(P<0.05)。RSV还能够上调脂肪组织APN表达,逆转T2DM小鼠低APN血症(P<0.01)。AMPK抑制剂Compound C可显著减弱RSV的心肌保护作用(P<0.05)。结论:RSV可通过逆转T2DM小鼠的低脂联素血症,在MI/RI时发挥对心肌的保护作用。

白杨素对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌Bax和Bcl-2表达的影响

目的:研究白杨素对心肌缺血再灌注损伤(MI/RI)大鼠的作用,同时观察其对心肌凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2表达的影响。方法:SPF级SD大鼠60只适应性喂养2周后,按体质量大小依次分为假手术组、模型组、阳性药物雷米普利组、白杨素低、中和高剂量组,每组10例,疗程2周,后采用可逆左冠状动脉前降支结扎法建立MI/RI模型,假手术组只穿线但不结扎。手术后收集血液检测血清肌酸激酶同功酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)、白细胞介素(Interleukin,IL)-6、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)含量,TTC法评估心肌梗死面积,HE染色观察心肌病理学,Western Blot检测心肌Bax和Bcl-2蛋白表达特点。结果:与假手术组比较,模型组心肌梗死面积明显增加(P<0.05),心肌纤维断裂,与模型组比较,白杨素3个剂量组和雷米普利组心肌梗死面积降低(P<0.05),心肌细胞形态改善;与假手术组比较,模型组血清CK-MB、LDH、IL-6和MDA增加(P<0.05),SOD降低(P<0.05),与模型组比较,白杨素3个剂量组和雷米普利组CK-MB、LDH、IL-6和MDA降低(P<0.05),SOD升高(P<0.05);与假手术组比较,模型组心肌Bax蛋白表达明显增加(P<0.05),Bcl-2表达降低(P<0.05),与模型组比较,白杨素3个剂量组和雷米普利组Bax蛋白表达降低(P<0.05),Bcl-2上调(P<0.05)。结论:白杨素对MI/RI大鼠血清心肌酶CK-MB和LDH,炎性因子IL-6,氧化和抗氧化指标MDA和SOD均有调节作用,同时可降低心肌梗死面积,其作用机制可能与白杨素能够调节Bcl-2和Bax蛋白表达有关。

心宁片对小鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用及其机制研究

目的研究心宁片对小鼠心肌缺血/再灌注损伤(MI/RI)的保护作用和作用机制。方法采用3种体外自由基体系测定心宁片的自由基清除能力。C57小鼠随机分为假手术组、模型组及心宁片高、中、低剂量组(心宁片10,20和30mg·kg-1),每组10只。结扎冠状动脉左前降支制备MI/RI模型,观察给药后小鼠心功能参数,测定体内抗氧化酶水平,Western Blot法检测核因子E2相关因子2蛋白表达。结果心宁片能够有效清除体外自由基,清除能力与维生素C相当。心宁片低、中、高剂量组能够明显改善心功能参数,升高体内抗氧化酶水平,促进核因子E2相关因子2蛋白表达。敲除核因子E2相关因子2蛋白后,心宁片调节氧化酶表达的能力被取消。结论心宁片对MI/RI具有保护作用,其作用机制有可能是通过直接清除自由基和促进核因子E2相关因子2蛋白表达,从而升高抗氧化酶水平。

睡眠剥夺在心肌缺血再灌注损伤中的研究进展

睡眠剥夺(sleep deprivation,SD)是指各种原因导致的睡眠不足的状态,可引起交感神经兴奋性增高,激素分泌紊乱,心律失常,内皮功能损伤,糖脂代谢异常以及炎症反应等多种病理变化。近年来研究发现,睡眠剥夺与心肌缺血再灌注损伤(myocardial/ischemia reperfusion injury,MI/RI)的发生发展密切相关。本文对SD在MI/RI中的作用及机制进行归纳总结,并简要介绍其在MI/RI中的最新治疗进展。

基于“温通心阳”功效的桂枝和肉桂配方颗粒对大鼠心肌缺血/再灌注损伤模型保护作用的实验研究

基于“温通心阳”功效平行观察桂枝配方颗粒(Cinnamomi Ramulus formula granules)和肉桂配方颗粒(Cinnamomi Cortex formula granules)对大鼠急性心肌缺血/再灌注损伤(myocardial ischemia/reperfusion injury, MI/RI)的保护作用及潜在机制。90只SD雄性大鼠按体质量随机分为假手术组(sham),模型组,桂枝与肉桂配方颗粒各自低、高剂量(0.5、1.0 g·kg^(-1))组,每组15只。造模前,各组大鼠每天灌胃给药1次,连续给药7 d, sham组和I/R组给予等体积生理盐水。末次给药1 h后,除sham组外,其余各组大鼠均采用结扎冠状动脉左前降支制备缺血30 min、再灌注120 min的MI/RI大鼠模型,假手术组大鼠仅穿针不予结扎,其余处理相同。考察桂枝和肉桂配方颗粒对MI/RI大鼠心肌功能、心肌梗死面积、心肌病理学和心肌超微结构的改变、心肌细胞凋亡、心肌损伤标志物及炎症因子的影响。RT-PCR法检测大鼠心肌组织中核苷酸结合寡聚化结构域样受体家族pyrin结构域蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor family pyrin domain protein 3, NLRP3)炎症小体、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD, ASC)、切割型半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-1(cysteinyl aspartate specific proteinase-1, caspase-1)、Gasdermin-D(GSDMD)、白细胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)和白细胞介素-18(interleukin-18, IL-18)等基因表达水平。Western blot法检测大鼠心肌组织中NLRP3、caspase-1、GSDMD和N-GSDMD等蛋白表达水平。桂枝和肉桂配方颗粒预处理均能明显改善MI/RI大鼠的心肌功能,减小心肌梗死面积,抑制心肌细胞凋亡,降低血清中乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase, LDH)、肌酸激酶MB同工酶(creatine kinase MB isoenzyme, CK-MB)、天冬氨酸转氨酶(aspartate transaminase, AST)和心肌肌钙蛋白Ⅰ(cardiac troponinⅠ, cTnⅠ)的含量。此外,桂枝和肉桂配方颗粒预处理能明显降低MI/RI大鼠血清中IL-1β、白细胞介素-6(interleukin-6, IL-6)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)水平。RT-PCR结果表明,桂枝和肉桂配方颗粒预处理能下调模型大鼠心肌NLRP3、caspase-1、ASC和下游细胞焦亡相关效应物质如GSDMD、IL-18和IL-1β的mRNA表达水平。Western blot结果显示,桂枝和肉桂配方颗粒预处理还可下调模型大鼠心肌NLRP3、caspase-1、GSDMD和N-GSDMD的蛋白表达。综上所述,桂枝和肉桂配方颗粒均对大鼠MI/RI具有明显的心肌保护作用,其机制可能与抑制NLRP3/caspase-1/GSDMD信号通路从而减轻心肌炎症反应有关。

柚皮苷对大鼠心肌缺血/再灌注损伤细胞凋亡的影响及作用机制

目的观察柚皮苷(Naringin,Nar)对大鼠心肌缺血/再灌注损伤(myocardial ischemia/reperfusion injury,MI/RI)细胞凋亡的影响,并探讨其作用机制。方法将10只大鼠经冠状动脉左前降支结扎30 min,再灌注120 min,建立MI/RI模型;低、中、高Nar干预组大鼠分别用10、20和40 mg/kg的Nar灌胃,1次/d,连续给药7 d,末次灌胃给药后60 min,进行MI/RI手术(同MI/RI模型组),每组10只;同时设假手术组(在冠状动脉前降支下只穿线不结扎)。采用TUNEL染色法检测细胞凋亡情况,Western blot法检测心肌组织中葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein78,GRP78)的表达水平。结果与假手术组比较,MI/RI模型组大鼠心肌细胞凋亡数和心肌组织中GRP78表达水平均明显升高(P<0.001);与MI/RI模型组相比,10、20和40 mg/kg Nar组大鼠心肌细胞凋亡数和心肌组织中GRP78表达水平均明显降低(P<0.01);与10 mg/kg Nar组比较,20和40 mg/kg Nar组的GRP78表达水平显著下调(P<0.001)。结论 Nar对MI/RI有明显保护作用,该作用可能与其抑制内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)相关蛋白GRP78的表达,减少细胞凋亡有关。