MyoD、Myf6和Mef2c慢病毒过表达载体构建及诱导猪MSC成肌向分化的研究

骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)是重要的成体干细胞,具有多向分化的能力,其成肌分化能力在医学上有广泛的应用,可用于多种疾病的治疗。成肌决定因子(MyoD)和成肌调节因子6(Myf6)同属生肌决定因子基因家族,控制着肌细胞的增殖分化,肌细胞增强因子(Mef2c)是一个具有重要功能的转录因子,可以作为心肌分化过程中的特异性标志。本试验通过构建猪MyoD、Myf6和Mef2c慢病毒表达载体,并在体外感染猪间充质干细胞(pMSC),成功在pMSC中过表达MyoD、Myf6和Mef2c三种调节因子,并且诱导MSC表达肌细胞生成素(MyoG)、肌肉特异型肌酸激酶(CKM)等重要的成肌相关因子。本研究为利用慢病毒过表达成肌相关因子诱导MSC细胞向成肌细胞分化奠定基础,为进一步探明MSC向成肌细胞分化的分子机制提供发新思路。

PI3K/Akt/mTOR信号通路在大鼠急性骨骼肌钝挫伤修复中的作用

目的:研究PI3K/Akt/mTOR信号通路在大鼠急性骨骼肌钝挫伤修复中的作用及变化趋势,探讨骨骼肌损伤修复的可能生物学机制。方法:SD大鼠随机分为正常对照组和损伤后1 d组、3 d组、5 d组、7 d组、14 d组,每组各6只,采用自制打击装置建立腓肠肌钝挫伤模型。HE染色观察各组腓肠肌的形态结构;免疫印迹检测各组腓肠肌中磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(Akt)、磷酸化的蛋白激酶B(P-Akt Ser473)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(P-mTORSer2448)的蛋白表达量;逆转录实时定量聚合酶链反应检测腓肠肌中成肌分化抗原(MyoD)、肌细胞生成素(MyoG)的mRNA相对表达量。结果:(1)HE染色结果显示:损伤后1 d可见肌细胞变性坏死,炎性细胞浸润;损伤后3 d和5 d可见新生的成肌细胞和肌管;损伤后7 d和14 d可见新生肌细胞和胶原纤维。(2)免疫印迹结果显示:与正常对照组比较,损伤后1 d、3 d、14 d组的各蛋白表达量升高,差异无统计学意义(P>0.05);损伤后5 d组PI3K、Akt、P-Akt Ser473表达量显著升高(P<0.01),mTOR和P-mTORSer2448表达量显著升高(P<0.05);损伤后7 d组PI3K、P-Akt Ser473、mTOR、P-mTORSer2448表达量显著升高(P<0.05),Akt表达量显著升高(P<0.01)。(3)逆转录实时定量聚合酶链反应结果显示:与正常对照组比较,损伤后1 d组Myo D1和MyoG的mRNA表达量显著升高(P<0.05,P<0.01);损伤后3 d、5 d、7 d各组Myo D1和Myo G的mRNA表达量显著升高(P<0.01);损伤后14 d组MyoG的mRNA表达量显著升高(P<0.05),MyoD1的mRNA表达量升高,但无统计学意义(P>0.05)。结论:PI3K/Akt/mTOR信号通路具有时间规律性地正向调控骨骼肌钝挫伤后的自我修复,可以作为临床治疗及科学研究骨骼肌损伤的靶点。

电针调控miRNA206/HDAC4轴促进损伤多裂肌修复过程中成肌细胞分化的机制

背景:作者前期的动物及细胞实验研究已证明电针可提高损伤腰多裂肌中Pax7 和成肌分化抗原的表达,促进多裂肌的损伤修复。亦有研究证明miRNA206 促进成肌分化主要是通过抑制组蛋白去乙酰化酶4 实现的。目的:观察电针对布比卡因致大鼠腰多裂肌损伤修复过程中miRNA206/组蛋白去乙酰化酶4 表达的影响。方法:实验方案经广东省第二中医院动物实验伦理委员会批准(批准号为048604)。将30 只雄性SD 大鼠随机分为对照组、模型组、电针组,每组10 只。模型组、电针组采用0.5%布比卡因肌内注射复制大鼠多裂肌损伤模型;对照组予注射等量生理盐水。对照组与模型组不进行针刺干预,电针组予针刺双侧委中穴、肾俞穴,针刺后连接电针,波形选用疏密波,电针频率采用2 Hz/10 Hz,电流强度选择1 mA,持续治疗20 min,每天治疗1 次,共治疗7 d。干预7 d 后,通过苏木精-伊红染色观察损伤部位多裂肌形态学变化,采用qRT-PCR检测多裂肌中miRNA206 的表达量,Western-blot 检测多裂肌中成肌分化抗原、Myogenin 及组蛋白去乙酰化酶4 蛋白的表达。结果与结论:①苏木精-伊红染色显示,7 d 后,对照组可见视野中骨骼肌纤维大部分排列整齐,无明显破坏及巨噬细胞浸润;模型组视野内可见大量肌纤维被破坏,但出现部分肌纤维修复,巨噬细胞数量仍较多;电针组新生肌纤维较多,巨噬细胞较模型组减少;②Western-blot 结果显示,7 d 后,模型组成肌分化抗原、Myogenin、组蛋白去乙酰化酶4 蛋白表达均较对照组升高(P < 0.05 或P < 0.01);电针组成肌分化抗原、Myogenin 蛋白表达较模型组升高(P < 0.01),组蛋白去乙酰化酶4 蛋白较模型组降低(P < 0.01);③qRT-PCR结果显示,7 d 后,模型组miRNA206 表达高于对照组(P < 0.01),电针组miRNA206 表达高于模型组(P <0.05);④结果说明,电针可促进多裂肌损伤后成肌分化,其作用可能是通过提高miRNA206 表达抑制组蛋白去乙酰化酶4 活性实现的。

KLHL31促进C2C12细胞的肌原分化

人类KLHL31基因是本实验室已克隆的基因,其蛋白质含有保守的BTB和串连重复的Kelch结构域,已有报道表明其在人类成体骨骼肌和心肌组织中特异表达。RT-PCR分析表明在C2C12细胞肌原分化过程中过表达KLHL31能够提高肌原分化标志基因MyoD与Myogenin的转录水平;荧光报告系统分析发现过表达KLHL31能够增强肌原分化相关基因MCK启动子的活性,表明KLHL31能够促进C2C12细胞的肌原分化。

电针干预经TGF-β1/Smad3信号通路对失神经肌萎缩大鼠肌卫星细胞分化的影响

目的:观察电针干预对失神经肌萎缩大鼠腓肠肌中转化生长因子β1(TGF-β1)/Smad3信号通路以及与肌卫星细胞分化密切相关的成肌分化抗原(Myod1)、组蛋白去乙酰化酶4(HDAC4)、微小RNA206(Mir-206)表达的影响,探讨电针延缓失神经肌萎缩发展的可能机制。方法:将24只雄性SD大鼠随机分为假手术组(n=8)、模型组(n=8)和电针组(n=8)。通过横断坐骨神经制备大鼠右后肢失神经肌萎缩模型。造模后对电针组大鼠术侧足三里、环跳穴进行电针干预,每次10 min,每日1次,每周6次,连续4周;假手术组和模型组大鼠不予电针干预。电针干预结束后计算各组大鼠的腓肠肌湿重比、HE染色测定腓肠肌纤维横截面积,实时荧光定量PCR法检测各组大鼠腓肠肌中肌卫星细胞分化相关因子mRNA的相对表达量。结果:4周后,模型组大鼠腓肠肌湿重比、肌纤维横截面积以及术侧腓肠肌中Smad7 mRNA相对表达量均低于假手术组和电针组,差异有统计学意义(P<0.05);模型组术侧腓肠肌中HDAC4、TGF-β1、转化生长因子β受体1(TGF-βr1)、TGF-βr2、Smad3 mRNA相对表达量均高于假手术组和电针组,差异有统计学意义(P<0.05);模型组术侧腓肠肌中Myod1、Mir-206 mRNA相对表达量高于假手术组,但低于电针组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:电针干预可能通过抑制TGF-β1/Smad3信号通路,下调HDAC4mRNA的表达,并上调Myod1、Mir-206 mRNA的表达促进肌卫星细胞的分化,从而延缓大鼠腓肠肌失神经肌萎缩的发展。

黄颡鱼MyoD基因的克隆及其表达

采用RT-PCR和RACE(cDNA末端快速扩增)方法克隆黄颡鱼MyoD(myogenic differentiation antigen,成肌分化抗原)基因的cDNA全长序列,对其进行生物信息学和在雌雄个体组织中的表达差异分析.结果表明,黄颡鱼MyoD基因编码区由810个碱基组成,编码269个氨基酸,其中第1～89个氨基酸为Basic区,第90～141个氨基酸为bHLH结构;黄颡鱼的MyoD基因与斑点叉尾鮰的同源性最高为93%.在雌雄成体组织中的表达分析显示,雄性个体中肌肉和胃组织中的表达量极显著高于雌性个体(p<0.01),雌性个体的肾脏和鳃组织中的表达量显著高于雄性(p<0.05).通过MyoD基因在雌雄个体中表现出的组织表达差异,认为这可能是造成黄颡鱼雌雄生长差异的重要因素之一.

电针“委中”对布比卡因致大鼠腰多裂肌损伤后再生及组织形态的影响

目的:观察电针"委中"对布比卡因(bupivacaine,BPVC)致大鼠腰多裂肌损伤后的干预作用,并探讨其作用机制。方法:将72只大鼠随机分为对照组、模型组、电针委中组、电针肾俞组,各组18只,每组大鼠再随机分为4d、7d、14d3个亚组,共12个亚组,每组6只。模型组、电针委中组和电针肾俞组采用0.5%BPVC肌内注射制备多裂肌损伤模型。电针委中组和电针肾俞组大鼠分别予以电针"委中""肾俞"治疗,每次20min,每天1次,各个亚组分别治疗4d、7d、14d;对照组和模型组同步进行捆绑固定。观察不同时间点多裂肌HE、Masson染色的形态学变化,肌纤维横截面积(cross sectional area,CSA)改变,免疫组化法观察胰岛素样生长因子(insulin like growth factor 1,IGF-1)和成肌分化抗原(myogenic differentiation antigen,MyoD)表达的变化情况。结果:造模后不同时间点多裂肌形态学改变显著,损伤后第14天仍未完全恢复,电针委中组与电针肾俞组从形态学上优于模型组。第7天时,电针委中组多裂肌肌纤维CSA大于模型组(P<0.05);第14天时,电针委中组和电针肾俞组均高于模型组(P<0.01,P<0.05)。第4、7天模型组多裂肌IGF-1的表达显著高于对照组(均P<0.01);第4天电针委中组表达显著高于模型组(P<0.01),电针委中组高于电针肾俞组(P<0.05),电针肾俞组表达高于模型组(P<0.05),第14天,电针肾俞组表达显著高于模型组与电针委中组(P<0.01)。第4天时,MyoD的表达两电针组显著高于模型组(P<0.01),其中电针委中组高于电针肾俞组(P<0.01)。结论:电针"委中"和电针"肾俞"均能促进腰多裂肌损伤后的再生,电针"委中"在多裂肌损伤后再生的早期阶段具有较好的促进作用,其机制可能与上调IGF-1和MyoD的表达并提前完成成肌细胞的分化有关。

电针血清对多裂肌卫星细胞增殖及Pax-7、成肌分化抗原、磷酸化蛋白激酶B表达的影响

目的:观察电针血清对大鼠多裂肌卫星细胞增殖及Pax-7、成肌分化抗原(MyoD)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)蛋白表达的影响,从血清学角度探讨电针促进多裂肌损伤修复的部分作用机制。方法:SD大鼠随机分为正常组、模型组、电针委中组、电针肾俞组,每组各8只,采用0.5%布比卡因肌肉注射复制多裂肌损伤模型,各电针组分别选取"委中"穴、"肾俞"穴进行电针治疗,每日1次,每次20min,4d后收集血清。原代培养大鼠腰多裂肌卫星细胞并进行鉴定,随机分为正常血清组、模型血清组、电针委中血清组、电针委中血清+LY 294002组、电针肾俞血清组、电针肾俞血清+LY 294002组,分别以各组血清培养24h,CCK-8、EdU法观察肌卫星细胞的增殖,Western blot法检测肌卫星细胞Pax-7、MyoD、p-Akt蛋白表达。结果:与正常血清组相比,模型血清组多裂肌卫星细胞增殖速度明显加快(P<0.01),两电针血清组又高于模型血清组(P<0.01)。与正常血清组相比,模型血清组MyoD、p-Akt表达明显升高(P<0.05),两电针血清组高于模型血清组(P<0.05,P<0.01)。与电针血清组相比,加LY 294002后,细胞增殖速度及MyoD、p-Akt表达均显著下降(P<0.01,P<0.05)。各组之间Pax-7蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论:电针"委中"血清和电针"肾俞"血清均可通过磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B通路促进肌卫星细胞的增殖,且有促进成肌分化的趋势。

电针干预对大鼠腓肠肌适应性肥大及肌卫星细胞增殖分化的影响

目的:观察不同时长电针干预对大鼠腓肠肌适应性肥大及腓肠肌中增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白表达及配对盒转录因子7(Pax 7)、成肌分化抗原(MyoD 1)、肌细胞生成素(MyoG)、肌球蛋白重链-Ⅰ(Myh 7)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、Smad 3mRNA表达的影响,探讨电针诱导骨骼肌适应性肥大的相关机制。方法:SD大鼠随机分为空白对照组、电针2周组、电针4周组和电针8周组,每组6只。除空白对照组,其余3组大鼠予以右侧"足三里"和"环跳"电针干预10min,每日1次,每周6次,分别持续干预2、4和8周。称重后计算各组大鼠腓肠肌湿重比,HE染色后测定腓肠肌肌纤维截面积及直径,免疫荧光标记法观察腓肠肌中PCNA蛋白的表达改变,实时荧光定量PCR法检测腓肠肌中Pax 7、MyoD 1、MyoG、Myh 7、TGF-β1、Smad 3mRNA相对表达量。结果:与空白对照组相比,腓肠肌中PCNA蛋白表达在电针2周组和电针4周组明显增多;大鼠腓肠肌湿重比、肌纤维截面积和直径及腓肠肌Pax 7、MyoD 1、MyoG、Myh 7、TGF-β1mRNA相对表达量随电针干预时间延长呈现先升高后降低的趋势,与空白对照组比较,Pax 7和TGF-β1mRNA相对表达量在干预2周时到达峰值(P<0.01),肌湿重比、肌纤维截面积和直径及MyoD 1、MyoG、Myh 7mRNA相对表达量在干预4周时到达峰值(P<0.01);腓肠肌中Smad 3mRNA相对表达量随电针干预时间延长呈现先下降后上升的趋势,在电针4周组到达低峰(P<0.01)。结论:电针干预"足三里"和"环跳"诱导大鼠腓肠肌产生时序性适应性肥大的改变可能是通过上调腓肠肌中Pax 7、PCNA、TGF-β1、MyoD 1、MyoG、Myh 7的表达,并下调Smad 3的表达,促进肌卫星细胞的增殖、成肌分化和肌管的终末分化,增加电针侧腓肠肌质量、肌纤维面积和直径而实现的。

电针对失神经大鼠腓肠肌中叉头蛋白转录因子3A/肌萎缩F-box蛋白及成肌分化抗原的影响

目的:观察电针干预对失神经肌萎缩大鼠腓肠肌中叉头蛋白转录因子3A(fork-head protein,FOXO3A)、肌萎缩F-box蛋白(muscle atrophy F-box,MAFbx)和成肌分化抗原(myogenic differentiation antigen,Myod1)蛋白及基因表达的影响,探讨电针延缓大鼠失神经肌萎缩的可能机制。方法:雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为假手术组、模型组及电针组,每组6只。采用钳夹坐骨神经法制备大鼠失神经腓肠肌萎缩模型。电针组选取大鼠术侧"足三里""环跳"穴进行治疗,每日1次,每次10min,连续干预14d后取材。计算各组大鼠腓肠肌湿重比,HE染色测定大鼠术侧腓肠肌纤维截面积和直径,Western blot检测大鼠术侧腓肠肌中FOXO3A、MAFbx、Myod1蛋白的相对表达量,实时荧光定量PCR检测大鼠术侧腓肠肌中FOXO3A、MAFbx及Myod1mRNA的相对表达量。结果:与假手术组相比,模型组大鼠腓肠肌湿重比、肌纤维截面积和直径均显著下降(P<0.01),电针组高于模型组(P<0.01)。与假手术组相比,模型组大鼠腓肠肌中FOXO3A、MAFbx、Myod1蛋白及mRNA表达量显著升高(P<0.01);与模型组相比,电针干预后FOXO3A、MAFbx蛋白及mRNA表达量显著降低(P<0.01),Myod1蛋白及mRNA表达量显著升高(P<0.01)。结论:电针可能通过抑制FOXO3A、MAFbx的表达同时上调Myod1的表达,影响骨骼肌蛋白水解的速率和肌卫星细胞分化的水平,在延缓失神经肌萎缩的同时促进肌萎缩修复。

电针血清对饥饿条件下肌卫星细胞成肌分化抗原及自噬蛋白Beclin 1表达的影响

目的:观察电针血清对饥饿条件下肌卫星细胞成肌分化抗原(Myod)及自噬相关蛋白Beclin 1表达的影响,探讨电针调控肌卫星细胞增殖及自噬的机制。方法:电针"委中"穴7 d后获取并制备不同浓度电针血清。分别以不同浓度(10%、20%、30%)的电针血清及10%胎牛血清对体外培养的原代肌卫星细胞干预12 h及24 h,CCK-8法检测各组细胞不同时间点的增殖情况,确定促进细胞增殖的最佳血清浓度。以无血清培养基培养原代肌卫星细胞12 h后,将细胞随机分为无血清组、10%胎牛血清组、最佳浓度电针血清组,分别加入相应浓度的血清。Western blot法检测不同血清干预12 h和24 h后原代肌卫星细胞中细胞增殖蛋白Myod及自噬蛋白Beclin 1的表达水平。结果:10%电针血清、20%电针血清、30%电针血清干预24 h后,肌卫星细胞增殖能力均优于10%胎牛血清(P<0. 01),但3个浓度电针血清之间的肌卫星细胞增殖能力无明显差异(P>0. 05),故取10%电针血清作为最佳浓度。Western blot结果显示:血清干预12 h后,无血清组肌卫星细胞中Myod及Beclin 1表达水平与干预前比较差异无统计学意义(P>0. 05),10%胎牛血清组、10%电针血清组Myod表达水平较干预前升高(P<0. 05)、Beclin 1表达水平较干预前降低(P<0. 05);与同时点无血清组比较,10%胎牛血清组、10%电针血清组Myod表达水平升高(P<0. 05)、Beclin 1表达水平降低(P<0. 01)。血清干预24 h后,无血清组Myod及Beclin 1表达水平较12 h时明显降低(P<0. 01),10%胎牛血清组、10%电针血清组Myod表达水平较12 h时升高(P<0. 05)、Beclin 1表达水平较12 h时降低(P<0. 05);与同时点无血清组比较,10%胎牛血清组、10%电针血清组Myod及Beclin 1表达水平均升高(P<0. 01,P<0. 05)。结论:饥饿条件下电针血清可改善肌卫星细胞的营养不良环境,抑制其凋亡趋势,促进肌卫星细胞增殖,这种作用可能是通过改善细胞的过度自噬实现的。

钙离子浓度对脂肪干细胞增殖和成肌分化的影响

目的:本研究旨在探讨钙离子浓度对脂肪干细胞(ADSCs)增殖和成肌分化的影响。方法:利用抽脂手术废弃脂肪提取脂肪干细胞,进行体外细胞培养和鉴定。设立正常细胞培养液为对照组,在培养液中添加不同浓度的钙离子(分别为0.001 mol/mL、0.002 mol/mL、0.003 mol/mL、0.004 mol/mL、0.005 mol/mL共5组)为实验组,测定在48 h和96 h条件下不同浓度钙离子(Ca^(2+))对cck8反应细胞增殖的影响。同时通过TGF-β诱导成肌分化,测定不同钙离子浓度下Ca^(2+)信号相关蛋白的表达,并通过CCK-8检测评价其分化水平。另外通过免疫荧光和PCR检测细胞表面特异性抗原(α-SMA,SMMHC)的表达水平。各组间比较应用独立样本t检验,P<0.05为差异具有统计学意义。结果:显微镜下观察可见原代ADSCs细胞培养0.5天后贴壁生长,形态呈圆或椭圆形,而TGF-β诱导ADSCs成肌分化可见细胞呈梭形;实验组中,钙浓度<0.002 mmol/mL时,脂肪干细胞增殖得到显著促进(t=10.08,df=10,P<0.05);钙浓度<0.003 mmol/mL时,脂肪干细胞的成肌分化也显著增加,同时免疫荧光和PCR检测发现低浓度下α-SMA,SMMHC的表达均显著增加(P<0.05),而高钙浓度下两者均受到抑制(P<0.05)。结论:低钙浓度(钙浓度<0.002 mmol/mL)可显著促进脂肪干细胞增殖和成肌分化,而高钙浓度下两者均受到抑制。