浙东白鹅骨骼肌发育相关因子MRFs,Pax3和Pax7基因的表达规律

生肌调节因子家族(myogenic regulatory factors,MRFs)在胚胎期和出壳早期的骨骼肌分化过程中发挥重要作用;PAX家族中的2个转录因子Pax3和Pax7,被认为在肌纤维的生长发育过程中,指导众多过程的形成。在鹅胚胎发育过程中这些基因的表达变化规律及在肌肉发育过程中的表达变化规律研究甚少。以浙东白鹅Anser cygnoides domestica‘Zhedong’为研究对象,提取RNA合成c DNA并采用实时荧光定量聚合酶链式反应(q RT-PCR)研究MRFs,Pax3和Pax7在鹅胚胎期(7,11,15,19,23,27 d胚龄)及出生早期(出雏后7日龄)的表达规律,并分析其表达与胸、腿肌发育的相关性。结果显示:MRFs,Pax3和Pax7基因均和鹅骨骼肌的发育相关,并且存在不同的表达规律。MRFs和Pax7基因在11~15 d胚龄期间出现表达高峰期,而Pax3基因在7 d胚龄即出现高表达,随后表达下降。通过分析表明:这些基因的表达规律均和它们在肌肉发育过程中的作用密切吻合。

基于C2C12细胞的2,7-二溴咔唑肌发育毒性效应

肌肉有执行机体运动和能量代谢的重要作用。据报道二噁英暴露可严重影响肌肉发育。但目前与多氯代二苯并呋喃(polychlorinated dibenzofurans,PCDFs)结构相似的卤代咔唑(polyhalogenated carbazoles,PHCZs)的肌肉发育毒性尚不明确。本研究旨在探究2,7-二溴咔唑(2,7-dibromo-9H-carbazole,27-BCZ)的肌肉发育毒性效应。应用C2C12细胞成肌分化模型,在细胞水平上通过苏木素-伊红染色法检测融合指数和单条肌管内细胞核数2个指标评价细胞形态的变化,在分子水平上通过qRT-PCR来测定肌细胞分化调节分子和分化标志物的基因表达,探究27-BCZ对肌发育的影响及其分子机制。细胞水平实验结果显示,与对照组相比,27-BCZ 10^(-7) mol·L^(-1)暴露3 d后,肌管数量减少、形态变细变短,且分布杂乱;单条肌管内细胞核数减少、参与肌管融合的细胞核比例(融合指数)降低;27-BCZ 10^(-9)~10^(-7) mol·L^(-1)暴露6 d后,虽然单条肌管内细胞核数没有显著变化,但融合指数显著降低。分子水平实验结果显示,27-BCZ 10^(-7) mol·L^(-1)在分化末期对肌纤维结构蛋白肌球蛋白重链(myosin heavy chain,MyHC)的2个编码基因Myh3和Myh4的表达具有显著抑制作用。另外,27-BCZ还影响肌生成调节因子家族(myogenic regulatory factors,MRFs)基因的表达,包括显著抑制分化早期调节因子MyoD和末期调节因子Mrf4的mRNA表达,显著促进Myogenin mRNA表达。此外,27-BCZ暴露能显著促进芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor,AhR)信号通路下游基因cyp1a1和cyp1b1的mRNA表达,提示27-BCZ在肌分化模型中具有类二噁英活性。总结上述结果,我们发现,在肌生成过程中,27-BCZ表现出与二噁英类似的AhR活性和肌发育干扰效应,为27-BCZ肌肉发育相关健康效应和AhR相关毒理机制研究提供了基础数据。

瘦素对鸭成肌细胞增殖与分化的影响

瘦素是一种重要的能量调控因子,存在于人体骨骼肌细胞,而瘦素在鸭肌肉生长和发育过程中的作用还不十分清楚。本实验采用离体培养鸭成肌细胞、CCK-8、荧光定量PCR等技术,探索瘦素调控鸭成肌细胞的增殖和分化机理。结果表明:1 ng/mL瘦素促进鸭成肌细胞生长,而10 ng/mL和100 ng/mL显著抑制成肌细胞生长(P<0.05);瘦素处理24 h后,1 ng/mL组的Myf5和MyoD的表达量最高,10 ng/mL组的Myf5和100 ng/mL组的MyoD的表达量最低(P<0.05);而MRF4和MyoG在各个浓度处理组的表达量均显著下降(P<0.05);1 ng/mL瘦素处理24 h后,AMPK和PI3K的表达量也显著升高(P<0.05),即AMPK和PI3K参与瘦素调控鸭成肌细胞生长发育过程;分别抑制AMPK和PI3K信号通路后,瘦素诱导Myf5和MyoD表达被减弱(P<0.05),而MRF4和MyoG的表达上升仅在AMPK被抑制组(P<0.05)。以上数据表明,瘦素可通过激活AMPK和PI3K信号通路调控鸭成肌细胞增殖和分化,但是AMPK信号通路作用性应大于PI3K信号通路。

卵形鲳鲹生肌调节因子基因家族的鉴定及在胚胎中的表达

为研究卵形鲳鲹生肌调节因子(MRF)在胚胎发育中所发挥的重要作用,对卵形鲳鲹MRF基因家族进行了全基因组鉴定和生物信息学分析,并对其在13个胚胎发育阶段的基因表达进行了定量分析。结果表明:在卵形鲳鲹基因组中共鉴定出5个MRF基因家族成员:MyoD1、MyoD2、Myf5、Myf6和MyoG,分别编码297、263、240、231、250个氨基酸。MRF家族基因存在典型的BASIC与HLH结构域,其中MyoD1、MyoD2与MyoG分别定位于9号、1号与2号染色体,而Myf5与Myf6基因均定位于22号染色体且位于同一基因座。MRF家族基因胚胎定量表达研究表明,MyoG在受精卵到胚体形成期表达量极低,在眼囊、耳囊与心脏跳动期表达量迅速升高,而到晶体出现期表达量又有所降低,推测其可能在眼囊、耳囊与心脏跳动期发挥主要的生肌调节作用,而后期在维持肌肉形态或肌肉发育中仍发挥重要作用。MyoD1、MyoD2、Myf5与Myf6在受精卵到原肠中期表达量较低,而从原肠末期到晶体出现期表达量迅速升高(P<0.05),表明其主要从原肠末期开始发挥生肌调控作用。结果表明,MRF家族成员在胚胎发育过程中发挥重要的作用,但不同的MRF家族成员发挥作用的时间及功能可能不同。

MRFs基因家族对肉品质影响的研究进展

生肌调节因子(MRFs)家族包括Myo D、Myo G、Myf5和Myf6这4种肌肉特异性转录因子,这些肌肉特异性转录因子控制着肌细胞的增殖和分化,与肌纤维的数量和大小密切相关,因而对肉质和风味都有着非常重要的作用。文章就MRFs家族的特性、作用及各成员对肉质的影响进行了综述,并展望了其应用前景。

几种不同动物骨骼肌肌球蛋白重链(MHC)亚型及成肌调节因子(MRFs)基因表达的比较

目的:比较测定几种不同动物骨骼肌肌球蛋白重链(MHC)亚型及成肌调节因子(MRFs)基因表达,引物均采用大鼠基因号设计,旨在比较观察其它动物与大鼠基因表达的交叉及相似度。方法:选用大鼠、家兔、牛与人的股外侧肌样本各6个,迅速用TRIZOL试剂匀浆固定,采用实时荧光-PCR法,测定骨骼肌MHCI,IIa,IIx,IIb四种亚型及成肌调节因子(MRFs)的mRNA基因表达。结果:未经内参较正的测定值,人、牛、兔的肌球蛋白重链(MHC)亚型及成肌调节因子(MRFs)基因表达均明显低于大鼠(P<0.01),提示各物种的同种基因存在差异性,其引物特异性较强;但经过内参校正后的测定值,人的MHC各亚型基因表达与大鼠含量较接近,有一定的交叉和基因相似性;而牛的含量虽可检出,但仍明显低于大鼠含量(P<0.01),表明其基因相似性较低;兔与大鼠基因未表现出相似性。提示,各物种同种基因的表达既存在差异性,又有一定的交叉和相似性。其蛋白水平的比较测定有待进一步研究。

成肌调节因子Myogenin和MRF4在人体失神经骨骼肌中的表达及其临床意义

目的 研究人体骨骼肌失神经支配后成肌调节因子Myogenin和MRF4蛋白的表达变化并了解其再生状态。方法 取 2 0例人体失神经后不同时间段的骨骼肌与 3例正常骨骼肌标本 ,HE染色和透射电镜观察肌细胞核变化 ,抗Myogenin和MRF4多克隆抗体免疫组织化学ABC法染色 ,统计阳性染色细胞核数 ,免疫荧光双重标记染色定性观察Myogenin和MRF4蛋白表达方式。结果 抗Myogenin和MRF4抗体阳性染色细胞核数在人体骨骼肌失神经支配时即开始升高并在 1年内维持在较高水平 ,1年后快速下降 ,至失神经 2年几乎消失。肌细胞核内移现象在失神经 1年内常见且部分居中的细胞核免疫组化染色阳性。结论 骨骼肌失神经支配 1年内 ,核内移可作为肌纤维再生的一个标志 ;Myogenin蛋白表达检测可以作为不可逆肌萎缩的指标 ;周围神经损伤后 ,应在 1年内尽早修复。

电针干预对大鼠腓肠肌适应性肥大及肌卫星细胞增殖分化的影响

目的:观察不同时长电针干预对大鼠腓肠肌适应性肥大及腓肠肌中增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白表达及配对盒转录因子7(Pax 7)、成肌分化抗原(MyoD 1)、肌细胞生成素(MyoG)、肌球蛋白重链-Ⅰ(Myh 7)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、Smad 3mRNA表达的影响,探讨电针诱导骨骼肌适应性肥大的相关机制。方法:SD大鼠随机分为空白对照组、电针2周组、电针4周组和电针8周组,每组6只。除空白对照组,其余3组大鼠予以右侧"足三里"和"环跳"电针干预10min,每日1次,每周6次,分别持续干预2、4和8周。称重后计算各组大鼠腓肠肌湿重比,HE染色后测定腓肠肌肌纤维截面积及直径,免疫荧光标记法观察腓肠肌中PCNA蛋白的表达改变,实时荧光定量PCR法检测腓肠肌中Pax 7、MyoD 1、MyoG、Myh 7、TGF-β1、Smad 3mRNA相对表达量。结果:与空白对照组相比,腓肠肌中PCNA蛋白表达在电针2周组和电针4周组明显增多;大鼠腓肠肌湿重比、肌纤维截面积和直径及腓肠肌Pax 7、MyoD 1、MyoG、Myh 7、TGF-β1mRNA相对表达量随电针干预时间延长呈现先升高后降低的趋势,与空白对照组比较,Pax 7和TGF-β1mRNA相对表达量在干预2周时到达峰值(P<0.01),肌湿重比、肌纤维截面积和直径及MyoD 1、MyoG、Myh 7mRNA相对表达量在干预4周时到达峰值(P<0.01);腓肠肌中Smad 3mRNA相对表达量随电针干预时间延长呈现先下降后上升的趋势,在电针4周组到达低峰(P<0.01)。结论:电针干预"足三里"和"环跳"诱导大鼠腓肠肌产生时序性适应性肥大的改变可能是通过上调腓肠肌中Pax 7、PCNA、TGF-β1、MyoD 1、MyoG、Myh 7的表达,并下调Smad 3的表达,促进肌卫星细胞的增殖、成肌分化和肌管的终末分化,增加电针侧腓肠肌质量、肌纤维面积和直径而实现的。

电针血清对多裂肌卫星细胞增殖及Pax-7、成肌分化抗原、磷酸化蛋白激酶B表达的影响

目的:观察电针血清对大鼠多裂肌卫星细胞增殖及Pax-7、成肌分化抗原(MyoD)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)蛋白表达的影响,从血清学角度探讨电针促进多裂肌损伤修复的部分作用机制。方法:SD大鼠随机分为正常组、模型组、电针委中组、电针肾俞组,每组各8只,采用0.5%布比卡因肌肉注射复制多裂肌损伤模型,各电针组分别选取"委中"穴、"肾俞"穴进行电针治疗,每日1次,每次20min,4d后收集血清。原代培养大鼠腰多裂肌卫星细胞并进行鉴定,随机分为正常血清组、模型血清组、电针委中血清组、电针委中血清+LY 294002组、电针肾俞血清组、电针肾俞血清+LY 294002组,分别以各组血清培养24h,CCK-8、EdU法观察肌卫星细胞的增殖,Western blot法检测肌卫星细胞Pax-7、MyoD、p-Akt蛋白表达。结果:与正常血清组相比,模型血清组多裂肌卫星细胞增殖速度明显加快(P<0.01),两电针血清组又高于模型血清组(P<0.01)。与正常血清组相比,模型血清组MyoD、p-Akt表达明显升高(P<0.05),两电针血清组高于模型血清组(P<0.05,P<0.01)。与电针血清组相比,加LY 294002后,细胞增殖速度及MyoD、p-Akt表达均显著下降(P<0.01,P<0.05)。各组之间Pax-7蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论:电针"委中"血清和电针"肾俞"血清均可通过磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B通路促进肌卫星细胞的增殖,且有促进成肌分化的趋势。

新型转录因子MDFIC的原核表达及多克隆抗体制备

小鼠MDFIC(MyoD family inhibitor domain containing)蛋白是一个新近发现的与HIC(Human I-mfa domain containing protein)高度同源的转录调控因子,可能在肌细胞的分化过程中起着重要的作用。为了深入研究MDFIC的功能,首先要制备抗MDFIC的多克隆抗体。首先采用PCR方法扩增出编码MDFIC的cDNA片段,然后将其克隆至原核表达载体pGEX-4T-3,并在大肠杆菌BL21中进行诱导表达。SDS-PAGE和Western blotting检测鉴定表达产物。亲和层析技术对融合蛋白进行纯化,纯化后的目的蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体。间接ELISA检测抗体效价达1∶640 000以上,检测证明抗体效价较高。此外,Western blotting结果显示,该抗体可特异性识别真核细胞外源性及内源性的MDFIC蛋白。MDFIC多克隆抗体的成功制备为进一步研究MDFIC的功能以及进一步探索肌细胞的发生分化机制提供了重要工具。

Rb1基因启动子和增强子的鉴定

视网膜母细胞瘤易感基因(retinoblastoma susceptibility gene)为癌变过程中的重要肿瘤抑制基因.该基因参与调控体内多个生理过程,主要包括细胞周期、细胞凋亡以及细胞分化等进程.Rb1主要通过与E2F1/DP1复合物的相互作用调控细胞周期运转和细胞凋亡过程.早期小鼠遗传学研究表明,Rb1基因缺失会导致骨骼肌细胞凋亡.进一步的研究表明,Rb1也能调节肌源调控因子(myogenic regulatory factors,MRFs)的转录活性,从而促进骨骼肌细胞分化.然而目前关于Rb1基因在骨骼肌发育过程中的表达调控机制尚未清晰.本文通过生物信息学分析、转基因小鼠模型、转录分析以及突变体分析等方法,初步鉴定了Rb1基因在骨骼肌中表达调控的启动子和增强子.结果表明:(1)生物信息学鉴定出的启动子和增强子之间存在明显的协同效应;(2)Rb1基因的启动子和增强子可以驱动LacZ报告基因在胚胎体节和成体骨骼肌组织中的表达;(3)启动子和增强子序列中保守E-box位点的突变会导致报告基因活性急剧下降;(4)MRFs能够激活Rb1基因启动子和增强子驱动的报告基因.这些研究发现有助于更全面地了解Rb1基因的转录调控.