微针导入重组Ⅲ型人源化胶原蛋白在皮肤屏障功能修复中的应用效果

目的探究微针导入重组Ⅲ型人源化胶原蛋白治疗因皮肤炎性衰老导致的皮肤屏障功能下降的有效性及安全性。方法选取2020年6月至2021年5月在本院接受面部皮肤治疗的30例患者作为研究对象,采用随机数字表法将其分为对照组(重组Ⅲ型人源化胶原蛋白)与治疗组(微针导入重组Ⅲ型人源化胶原蛋白),各15例。治疗后定期对患者进行随访,分别进行主观疗效评价及客观疗效评价。结果治疗后4、8、12周,治疗组的满意度显著高于对照组(P<0.05)。治疗后,治疗组的皮肤皱纹、纹理、红区、毛孔、弹性、皮肤经皮失水及皮肤含水量改善明显(P<0.05);对照组治疗后油脂改善明显(P<0.05)。治疗后12周,治疗组的总症状评分显著低于对照组(P<0.05)。结论微针导入重组Ⅲ型人源化胶原蛋白对皮肤修复有较好的疗效,可增强皮肤屏障功能,为改善皮肤屏障功能、治疗因皮肤屏障受损引起的炎性衰老提供了新选择。

重组组织型纤维蛋白溶酶原激活剂静脉溶栓后不同时间加用替罗非班对急性缺血性脑卒中患者神经血管功能的影响

目的探讨重组组织型纤维蛋白溶酶原激活剂(rt-PA)静脉溶栓后不同时间加用替罗非班对急性缺血性脑卒中(AIS)患者神经血管功能的影响。方法选择2020年3月至2023年3月北京老年医院神经内科收治的120例AIS患者为研究对象,患者均经rt-PA静脉溶栓治疗。根据静脉溶栓治疗后加用替罗非班的时间将患者分为早期组(溶栓后6 h内,n=52)、中期组(溶栓后6~12 h,n=38)和晚期组(溶栓后12~24 h,n=30)。比较治疗前、治疗后3组患者神经功能[美国国立卫生院卒中量表(NIHSS)评分、改良Rankin量表(mRS)评分]、血管功能[血管性假血友病因子(vWF)、血管内皮细胞钙黏蛋白(VE-cadherin)、血栓调节蛋白(TM)]、炎症因子[高敏C反应蛋白(hs-CRP)、同型半胱氨酸(Hcy)、白细胞介素-1β(IL-1β)]水平,记录治疗期间不良事件发生率。结果治疗前,3组患者NIHSS、mRS评分比较差异无统计学意义(P>0.05);3组患者治疗后NIHSS、mRS评分显著低于治疗前(P<0.05);治疗后,早期组患者NIHSS、mRS评分显著低于中期组、晚期组,中期组患者NIHSS、mRS评分显著低于晚期组(P<0.05)。治疗前,3组患者vWF、VE-cadherin、TM水平比较差异无统计学意义(P>0.05);3组患者治疗后vWF、VE-cadherin、TM水平显著低于治疗前(P<0.05);治疗后,早期组患者vWF、VE-cadherin、TM水平显著低于中期组、晚期组(P<0.05);治疗后,晚期组患者vWF水平显著高于中期组(P<0.05),中期组与晚期组患者VE-cadherin、TM水平差比较异无统计学意义(P>0.05)。治疗前,3组患者hs-CRP、Hcy、IL-1β水平比较差异无统计学意义(P>0.05),3组患者治疗后hs-CRP、Hcy、IL-1β水平显著低于治疗前(P<0.05);治疗后,早期组患者hs-CRP、Hcy、IL-1β水平显著低于中期组和晚期组,中期组患者hs-CRP、Hcy、IL-1β水平显著低于晚期组(P<0.05)。治疗期间,3组患者症状性脑出血发生率比较差异无统计学意义(P>0.05);早期组患者再闭塞、心肺并发症发生率显著低于中期组、晚期组(P<0.05);中期组与晚期组患者再闭塞、心肺并发症发生率比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论rt-PA静脉溶栓后不同时间加用替罗非班后均可促进AIS患者神经功能、血管功能恢复,同时可抑制炎症反应,其中早期加用替罗非班效果最佳。

重组贻贝粘蛋白在点阵CO_(2)激光治疗面部痤疮萎缩性瘢痕术后创面修复中的应用研究

目的:探究重组贻贝粘蛋白水凝胶敷料(Recombined mussel adhesive protein hydrogel dressing,Rmaphd)在点阵CO_(2)激光治疗面部痤疮萎缩性瘢痕术后创面修复中的应用效果。方法:选择2022年6月-2023年2月面部痤疮萎缩性瘢痕患者117例,分为Rmaphd组、重组人表皮生长因子(Recombinant human epidermal growth factor,rhEGF)组和对照组,每组39例,三组均给予点阵CO_(2)激光术治疗,术后分别给予Rmaphd、rhEGF及生理盐水处理,比较三组疗效、ECCA评分、症状持续时间以及生活质量评分。结果:Rmaphd组和rhEGF组总有效率分别为92.31%和94.87%,均高于对照组76.92%(P<0.05),术后ECCA评分低于对照组(P<0.05),术后疼痛、红斑、痂皮持续时间短于对照组(P<0.05),Acne-QoL各指标得分优于对照组(P<0.05);上述各临床Rmaphd组与rhEGF组差异无统计学意义(P>0.05)。结论:Rmaphd用于点阵CO_(2)激光治疗面部痤疮萎缩性瘢痕术后创面修复疗效显著,具备在临床上辅助激光治疗术后修复的应用潜力。

重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白治疗中毒性表皮坏死松解症的疗效及安全性

目的探讨重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(rhTNFR:Fc)治疗中毒性表皮坏死松解症(TEN)患者的临床疗效及安全性。方法回顾性选取2020年1月至2022年1月海南医学院第一附属医院TEN患者20例,均给予rhTNFR:Fc治疗。治疗21 d后,记录TEN患者临床疗效,比较治疗前与治疗后不同时段(治疗后7、14、21 d)的药疹面积和严重程度指数(DASI)评分[DASI评分平均值,50%DASI(DASI50)、75%DASI(DASI75)、90%DASI(DASI90)所占比例]、血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平、体温下降时间、皮疹控制时间、住院时间及药物治疗的安全性。结果治疗21 d后,TEN患者中,显效18例(90.00%),有效2例(10.00%)。TEN患者治疗后7、14、21 d的DASI评分分别为(30.44±5.68)、(5.28±2.31)、(2.04±1.12)分,均明显低于治疗前[(52.34±7.45)分],差异均有统计学意义(P<0.05)。相较治疗前、治疗7 d、治疗14 d,治疗21 d后的DASI50(100.00%)、DASI75(100.00%)、DASI90(90.00%)的改善比率最高,差异均有统计学意义(P<0.05)。TEN患者治疗后7、14、21 d的血清TNF-α水平分别为(22.73±5.58)、(15.99±4.60)、(4.44±1.10)pg/mL,均低于治疗前[(33.63±17.36)pg/mL],差异均有统计学意义(P<0.05)。TEN患者体温下降时间为(2.49±0.81)d,皮疹控制时间为(5.19±1.90)d,住院时间为(11.92±4.20)d。治疗期间患者未出现终止治疗或失访,均未出现急性不良反应,随访期间病情未见复发,定期复查结果显示并无合并症、活动性肝炎与结核疾病等。结论rhTNFR:Fc作为治疗TEN疾病的药物其疗效随治疗时间延长而提高,可降低血清TNF-α水平与DASI评分,且安全性较高。

重组贻贝粘蛋白改善面部敏感性皮肤临床疗效及安全性探讨

研究重组贻贝粘蛋白在面部敏感性皮肤治疗中的临床疗效及安全性。方法 选取2022年9月-2023年9月凉山州第一人民医院确诊的79例面部敏感性皮肤为研究对象,使用随机数字表法分为两组,使用重组贻贝粘蛋白凝胶的40例患者纳入的干预组,使用该产品凝胶基质的39例患者纳入对照组,治疗4周后,比较两组症状改善效果、红区数值、弹性、光泽度、皮肤病生活质量评分及不良反应。结果 治疗后,干预组与对照组相比,症状改善VAS评分下降更多,15min即刻改善症状;皮肤光泽度、弹性评分更高,面部红斑面积减少更加明显;患者生活综合质量有更为明显的提升,差异具有统计学意义。结论 在面部敏感性皮肤的临床治疗中,重组贻贝粘蛋白可即刻改善患者各种面部不适症状,提高患者生活质量,安全性和有效性可靠,值得临床推广使用。

表达非洲猪瘟病毒p72蛋白重组猪痘病毒的构建及鉴定

【目的】旨在构建能高效表达非洲猪瘟病毒p72蛋白的重组猪痘病毒,为探索猪痘病毒(SPV)作为非洲猪瘟新型活疫苗载体的可行性。【方法】本研究优化合成非洲猪瘟病毒B646L基因,克隆至重组猪痘病毒通用转移载体pUSG11/P28,构建重组转移质粒pUSG11/P28-B646L,经脂质体介导转染预先感染猪痘病毒的PK15细胞,出现病变后通过绿色荧光标记筛选和纯化重组病毒。拯救的重组病毒经PCR和基因测序鉴定后,通过Western blotting和间接免疫荧光试验检测p72蛋白的表达情况,并测定重组病毒的增殖特性和遗传稳定性。【结果】重组转移质粒pUSG11/P28-B646L在PK15细胞内和SPV成功进行了同源重组,纯化得到的重组病毒含有B646L基因,且基因序列正确。Western blotting和间接免疫荧光试验结果表明,重组病毒rSPV-B646L在PK15细胞中能表达非洲猪瘟病毒p72蛋白,表达的蛋白大小正确,且能与p72单克隆抗体发生特异性反应。一步生长曲线显示,重组病毒与亲本病毒的增殖特性没有明显差异。重组病毒在PK15细胞上连续传15代后,插入的外源基因没有发生突变或缺失。【结论】研究以SPV为载体,成功构建了正确表达非洲猪瘟病毒p72蛋白的重组猪痘病毒,重组病毒在PK15细胞中有良好的遗传稳定性,B646L基因的插入没有影响重组病毒在PK15细胞上的增殖能力,表达的p72蛋白具有反应原性。研究成果为非洲猪瘟多基因重组猪痘病毒载体疫苗的研发提供依据。

重组荔枝类甜蛋白的高效表达、纯化及活性鉴定

荔枝类甜蛋白(litchi thaumatin-like protein,LcTLP)是导致部分人群过量食用荔枝引起机体炎症反应的主要原因之一,为深入探究其引起的机体炎症机制,揭示其晶体结构与促炎活性位点等生物学特性,需获得大量高纯度LcTLP。然而现有报道中鲜见大量获取高纯度可溶性LcTLP的提取方法,因此该研究对LcTLP基因进行密码子优化后构建了表达载体pCold-NusA-LcTLP,并成功表达了可溶重组蛋白NusA-LcTLP。通过亲和层析与凝胶过滤层析两步纯化法,最终得到的重组蛋白产量可达36.26 mg/L,纯度达90%以上,表明该纯化方案可高效制得高纯度重组LcTLP。经RAW264.7细胞炎症活性验证,重组LcTLP在1、2μg/mL时刺激细胞NO分泌量分别为12.75、14.68μmol/L,为空白组的2.91、3.36倍,验证了重组LcTLP具有一定的促炎活性。该表达载体与纯化方案高效表达得到了可溶性重组LcTLP,为后续深入研究LcTLP在细胞生命活动中的功能机制奠定了基础。

济麦44/济麦229重组自交系群体籽粒蛋白质含量QTL分析

小麦籽粒蛋白质含量与面团流变学特性及加工特性的关系密不可分。本研究在2020—2021年济南试验基地(E1)及2021—2022年济南试验基地(E2)和济阳试验基地(E3)三个环境下,以“济麦44×济麦229”构建的包含285个家系的重组自交系群体(F2∶6RILs)为材料,利用小麦55K SNP芯片构建高密度遗传连锁图谱,对籽粒蛋白质含量进行QTL分析。结果共筛选到2344个SNP标记用于构建遗传连锁图谱,图谱总长度3349.95 cM,平均标记密度为1.43 cM/标记。通过对籽粒蛋白质含量的QTL分析,共检测到18个籽粒蛋白质含量相关QTL,分布在1A、1B、2B、3D、4B、4D、5A、5B、5D、7A、7B共11条染色体上。Qpc.saas.4B-1在E1、E2和E3三个环境和BLUE(最佳线性无偏估计)值中均被稳定检测到,可以解释3.26%~23.79%的表型变异。Qpc.saas.4D和Qpc.saas.5A在两个环境和BLUE值中被检测到,分别解释2.42%~11.18%和2.48%~5.47%的表型变异,且Qpc.saas.4D与小麦矮秆基因Rht-D1b物理位置重合。本研究中检测到的QTL新位点Qpc.saas.4B-1、Qpc.saas.4D和Qpc.saas.5A是控制籽粒蛋白质含量的主效基因,具有高表型变异解释率。本研究结果可为小麦品质育种提供分子标记及理论参考。

表达鸡传染性贫血病毒VP1蛋白的新型重组血清4型禽腺病毒的构建

为研制新型鸡传染性贫血(CIA)高效疫苗以解决国内商品鸡群中普遍存在的鸡传染性贫血病毒(CIAV)感染问题,试验利用CRISPR-Cas9技术和Cre-LoxP系统,以血清4型禽腺病毒(FAdV-4)为载体,构建表达CIAV VP1蛋白的重组FAdV-4。通过间接免疫荧光试验和蛋白免疫印迹试验对重组病毒进行验证,通过体外病毒生长曲线来研究其复制效率。结果显示:该重组病毒构建成功,能有效表达CIAV VP1蛋白,命名为rFAdV-4-CIAV-VP1,且发现rFAdV-4-CIAV-VP1在LMH细胞中的复制效率远低于野生型FAdV-4。研究表明构建的重组病毒rFAdV-4-CIAV-VP1为CIAV和FAdV-4的联防联控提供了二联候选疫苗株。

重组牛乳过敏原β-乳球蛋白的可溶性表达及其特性分析

目的实现β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,BLG)的可溶性表达,并比较重组BLG和天然BLG在结构和免疫原性两个方面的差异性。方法将pET-30a-BLG重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)进行体外诱导表达,并对表达条件进行优化,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳方法分析重组蛋白的可溶性。利用荧光光谱和圆二色谱比较重组BLG空间结构变化,同时采用竞争抑制酶联免疫吸附实验评价重组BLG致敏性能力。结果在Tris-HCl溶液体系中重组BLG的可溶性表达可达到50%以上,可溶性表达的最优条件为:在Tris-HCl溶液体系中,诱导温度为37℃,IPTG终浓度1.0 mmol/L,诱导4 h。重组BLG表面疏水性下降,可溶性重组BLG的α-螺旋结构减少,经除盐处理后致敏性下降,包涵体重组BLG无规则卷曲结构减少、致敏性上升。结论本研究成功从上清液中纯化得到可溶性重组BLG,且可溶性表达获得的BLG空间结构更接近天然蛋白。

高蛋白重组米理化特性、结构特征与营养品质研究

高蛋白重组米是是指以大米为主要原料,运用蛋白质强化技术手段,经双螺杆挤压、切割、干燥等一系列工序制成与天然大米类似的颗粒米状制品,其蛋白含量(干基)≥12 g/100 g。研究以非高蛋白重组米(市售)、普通大米为对照,对自制和市售高蛋白重组米的食味值、滋气味特性、结构特征、消化特性和营养品质指标等进行全面系统分析研究,为满足蛋白质摄入不足的人群的营养需求,开发高蛋白重组米提供参考。研究结果表明:高蛋白重组米在有机硫化物、硫化物、氮氧化合物等挥发性气味组分含量方面明显高于对照样品(P<0.05);挤压重组工艺和蛋白质的添加对滋味特征不产生显著影响(P>0.05);挤压重组高蛋白大米淀粉晶型为V型结晶的特征;挤压重组米淀粉相对结晶度在6.1%,低于对照普通大米相对结晶度19.8%;高蛋白重组米蒸煮截面呈现密集蜂窝状微孔;挤压重组米抗性淀粉(RS)质量分数在17%以上,高于对照普通大米RS质量分数14%;自制高蛋白重组米中必需氨基酸和总氨基酸含量分别为49.45、129.00 mg/g,均显著高于对照(P>0.05),必需氨基酸与非必需氨基酸、总氨基酸比例分别为62.17%、40.86%,均与FAO/WHO推荐的理想蛋白质模式接近。

玻璃体内注射原纤维蛋白-2(FBN2)重组蛋白对FBN2缺陷型视网膜病变的影响

目的探讨玻璃体内注射原纤维蛋白-2(FBN2)重组蛋白对FBN2缺陷型视网膜病变的影响。方法取SPF级C57BL/6J小鼠32只,随机分为4组:正常对照组、阴性对照组、FBN2敲减组、FBN2重组蛋白组,每组8只小鼠,取右眼作为实验眼。入组后,正常对照组小鼠不进行干预,阴性对照组小鼠玻璃体内注射3μL空载体(1 mg·L^(-1)),FBN2敲减组及FBN2重组蛋白组小鼠玻璃体内注射3μL腺相关病毒(AAV)(1 mg·L^(-1)),4周后FBN2重组蛋白组小鼠玻璃体内注射3μL FBN2重组蛋白(1 mg·L^(-1))。采用视网膜电图(ERG)视觉电生理仪和光学相干断层扫描(OCT)仪分别检测小鼠视网膜Rod-b、Max-a波振幅和视网膜结构变化;RT-PCR、Western blot检测小鼠视网膜中FBN2、微原纤维相关糖蛋白(MAGP-2)、Ⅰ型胶原蛋白(COL1)mRNA和蛋白表达变化。结果ERG检测结果显示,与阴性对照组和正常对照组相比,FBN2敲减组和FBN2重组蛋白组小鼠视网膜ERG Rod-b、Max-a波振幅均变小(均为P<0.05);与FBN2敲减组相比,FBN2重组蛋白组视网膜ERG Rod-b、Max-a波振幅均明显增加(均为P<0.05)。OCT检测结果显示,与FBN2敲减组相比,FBN2重组蛋白组小鼠视网膜色素上皮层组织结构恢复正常,光反射变规则。RT-PCR检测结果显示,与FBN2敲减组相比,FBN2重组蛋白组小鼠视网膜组织FBN2 mRNA表达明显升高,COL1、MAGP-2 mRNA表达均明显降低(均为P<0.05)。Western blot检测结果显示,与FBN2敲减组相比,FBN2重组蛋白组小鼠视网膜组织FBN2蛋白表达明显升高,COL1、MAGP-2蛋白表达均明显降低(均为P<0.05)。结论玻璃体内注射FBN2重组蛋白可以弥补FBN2缺陷型视网膜病变小鼠FBN2内源性缺失,通过调控COL1、MAGP-2表达可达到治疗疾病的作用。

类鼻疽菌Ⅲ型分泌系统BipD蛋白的重组表达及其免疫学特性研究

目的重组表达类鼻疽菌Ⅲ型分泌系统BipD蛋白,制备多克隆抗体并鉴定其免疫学性质。方法利用pET-28a表达系统在Eschericahia coli(E.coli)BL21(DE3)中重组表达BipD蛋白,通过His Trap亲和层析纯化获得rBipD蛋白,免疫BALB/c小鼠获得rBipD多克隆抗体;分别用兔抗类鼻疽菌血清和类鼻疽菌感染阳性患者血清进行Western blot实验检测rBipD的免疫反应性;通过Western blot及免疫荧光染色检测鉴定rBipD的免疫原性;以rBipD建立间接ELISA检测临床类鼻疽患者血清抗体。结果成功构建pET-28a-BipD重组质粒并转化至E.coli BL21(DE3)中诱导表达、纯化获得了相对分子质量约为36×10^(3)的rBipD蛋白,纯度约为95.4%。rBipD蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性。免疫小鼠可产生特异性抗体,制备鼠抗rBipD多克隆抗体,效价达1∶512000。5.0μg/mL rBipD蛋白可与类鼻疽患者血清发生免疫反应,而不与结核患者血清发生免疫反应,差异有统计学意义(P<0.01)。结论成功制备了具有免疫学活性的rBipD蛋白及其多克隆抗体,为其用于临床免疫学诊断和类鼻疽菌感染免疫机制研究提供了良好的工具。

含重组人碱性成纤维细胞生长因子和重组人骨形态发生蛋白-2骨水泥在骨质疏松性腰椎压缩性骨折治疗的应用价值

目的:探讨含重组人碱性成纤维细胞生长因子(recombinant human basic fibroblast growth factor,rhbFGF)和重组人骨形态发生蛋白-2(recombinant human bone morphogenetic protein-2,rhBMP-2)骨水泥在骨质疏松性腰椎压缩性骨折(osteoporotic vertebral compression fracture,OVCF)患者经皮椎体后凸成形术(percutaneous kyphoplasty,PKP)治疗的应用价值。方法:回顾性分析2018年1月至2021年1月收治的103例行PKP手术治疗的OVCF患者,男40例,女63例;年龄61~78(65.72±3.29)岁。受伤原因:滑倒33例,跌倒42例,提重物受伤28例。根据填充骨水泥不同分为3组:磷酸钙组34例,男14例,女20例,年龄(65.1±3.3)岁,填充磷酸钙骨水泥;rhBMP-2组34例,男12例,女22例,年龄(64.8±3.2)岁,填充含rhBMP-2的骨水泥;rhbFGF+rhBMP-2组35例,男14例,女21例,年龄(65.1±3.6)岁,填充含rhbFGF和rhBMP-2的骨水泥。比较3组Oswestry功能障碍指数(Oswestry dysfunction index,ODI)、骨密度、椎体前缘丢失高度、伤椎前缘压缩率、疼痛视觉模拟评分(visual simulation score,VAS)及再骨折发生率。结果:所有患者获得12个月随访。3组术后ODI、VAS呈下降(P<0.001),骨密度增高(P<0.001),椎体前缘丢失高度、伤椎前缘压缩率呈先下降后缓慢上升趋势(P<0.001),rhbFGF+rhBMP-2组术后第1、6、12个月ODI、VAS均低于rhBMP-2组和磷酸钙组(P<0.05),术后第6、12个月骨密度大于rhBMP-2组和磷酸钙组(P<0.05)。rhbFGF+rhBMP-2组术后第6、12个月椎体前缘丢失高度、伤椎前缘压缩率均低于rhBMP-2组和磷酸钙组(P<0.05)。3组再骨折发生率比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:含rhbFGF和rhBMP-2骨水泥可更有效地增加OVCF患者骨密度,获得术后满意的临床和放射学效果,显著改善临床症状。

表达鸭坦布苏病毒衣壳蛋白的重组腺病毒载体构建与鉴定

为构建鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)衣壳蛋白的复制缺陷型人5型腺病毒(Ad5)为载体的重组腺病毒,研究通过一步克隆技术将DTMUV Capsid基因插入到含有结核分枝杆菌的热休克蛋白70(mHsp70)为佐剂的pShuttle-CMV-Hsp70质粒中,构建能够表达DTMUV Capsid和mHsp70蛋白的重组穿梭质粒pShuttle-DTMUV Capsid,并与含有pAdEasy-1腺病毒骨架载体的大肠杆菌BJ5183感受态细胞进行同源重组,获得重组腺病毒质粒pAd-DTMUV Capsid。载体质粒经Pac I酶切线性化后转染至HEK 293A细胞,包装重组腺病毒rAdv-DTMUV Capsid。结果显示,rAdv-DTMUV Capsid在病毒传代过程中目的基因稳定存在,且病毒滴度可达2.3×10^(8)PFU/mL。Western blot等结果表明rAdv-DTMUV Capsid在HEK 293A细胞中表达了DTMUV特异性蛋白Capsid。DEF细胞感染试验证明rAdv-DTMUV Capsid可感染鸭源细胞,且诱导IFN-α、IL-10和IL-17 mRNA表达。结果表明,研究成功制备表达DTMUV Capsid蛋白的重组腺病毒rAdv-DTMUV Capsid,能引起细胞免疫反应,可作为一种候选疫苗。

补充重组人源胶原蛋白对离心运动后小鼠骨骼肌细胞外基质重塑的影响

背景:胶原蛋白是含量最为丰富的胞外基质成分,与骨骼肌细胞外基质的结构、功能密切相关,但补充由生物工程技术生产的重组人源胶原蛋白(recombinant human collagen,rhC)对骨骼肌细胞外基质的影响及机制尚不清楚。目的:探讨补充rhC对离心运动后骨骼肌细胞外基质重塑的影响及作用机制。方法:将104只8周龄健康雄性C57小鼠随机分为对照组(生理盐水)、rhC低剂量组(0.2 g/kg)、中剂量组(1.0 g/kg)和高剂量组(2.0 g/kg),连续7 d灌胃干预后每组选取2只小鼠,解剖各脏器进行苏木精-伊红染色判断炎性浸润情况,其余小鼠于第8天进行离心运动,分别在离心运动后即刻(0),24,48,96 h观察细胞外基质结构变化,检测小鼠抓握力、血清肌酸激酶活性、骨骼肌组织基质金属蛋白酶2,9,14和基质金属蛋白酶抑制剂2的蛋白水平。结果与结论:①苏木精-伊红染色观察短期补充rhC对心脏、肝脏、脾、肾无显著影响;②一次性离心运动后,rhC中、高剂量组小鼠抓握力恢复率显著升高(P<0.01);③各组肌酸激酶变化趋势一致,组间无显著性差异;④rhC低剂量组细胞外基质恢复进程快于对照组,rhC中、高剂量组肌束膜较为完整;⑤rhC高剂量组基质金属蛋白酶9蛋白水平显著降低(P<0.05);⑥rhC中、高剂量组基质金属蛋白酶14蛋白水平显著降低(P<0.05);⑦rhC中、高剂量组基质金属蛋白酶2蛋白水平显著降低(P<0.05);⑧rhC中、高剂量组基质金属蛋白酶抑制剂2蛋白水平显著升高(P<0.05);⑨rhC各剂量组基质金属蛋白酶2/基质金属蛋白酶抑制剂2比值显著降低(P<0.05)。该研究发现连续7 d预补充1.0,2.0 g/kg rhC可通过调节基质金属蛋白酶和基质金属蛋白酶抑制剂来抑制运动后骨骼肌细胞外基质降解,从而促进小鼠骨骼肌力量恢复。

重组人糖蛋白激素β5/α2融合蛋白在CHO-S细胞中的表达纯化及功能活性分析

目的在悬浮中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells,CHO-S)中分泌表达、纯化重组hCGH-CTP融合蛋白,验证其对3T3-L1成熟脂肪细胞脂质积累的影响。方法构建CTP连接肽融合人糖蛋白激素β5/α2重组蛋白表达载体pcDNA3.1-rhCGH-CTP,将其瞬时转染CHO-S悬浮细胞中,大量表达纯化并验证rhCGH-CTP蛋白生物学活性;通过干预3T3-L1成熟脂肪细胞24 h,观察细胞内甘油三酯(TG)水平的变化。结果Western blot结果显示,rhCGH-CTP蛋白在CHO-S细胞中成功表达,表达量可达715.4 mg·L^(-1);用AKTA pure蛋白纯化系统纯化蛋白,SDS-PAGE方法鉴定纯化出的蛋白纯度较高可达90%。此外,在高表达TSHR基因的成熟脂肪细胞3T3-L1中,利用ELISA试剂盒测定不同浓度rhCGH-CTP蛋白干预后胞内cAMP含量明显升高,说明rhCGH-CTP蛋白具有生物活性;油红O染色结果发现,与对照组相比,不同浓度rhCGH-CTP蛋白干预组的成熟脂肪细胞中TG含量明显降低(P<0.05)。结论成功表达并纯化了rhCGH-CTP融合蛋白,其具有良好的生物学活性并能有效降低TG,该研究为后续深入揭示CGH蛋白的生理作用及在临床实践中的潜在应用提供了重要基础。

表达元件优化促进重组胶原蛋白在谷氨酸棒杆菌中的表达

重组胶原蛋白是一种具有广泛应用潜力的生物材料,近年来引起了生物医学、组织工程等众多领域的关注。胶原蛋白的3股螺旋结构赋予其独特的生物学功能和生物相容性,但也增加了其在微生物系统中表达的复杂性。该研究以细菌胶原蛋白V-B作为模式蛋白,通过对表达元件的优化,促进重组胶原蛋白在谷氨酸棒杆菌中的表达。首先通过启动子筛选和发酵时长优化,获得介导V-B表达的最优启动子tac-R0。接着利用RBS calculator设计核糖体结合位点(ribosomal binding site,RBS)和间隔序列(aligned spacing,AS)的突变文库,得到与tac-R0启动子搭配组合的最优RBS和AS,使V-B的产量提高至514 mg/L。此外,通过多基因表达盒的串联组合策略,将多个目的基因串联,最终V-B的产量较初始水平提高了8.4倍,达697 mg/L,该研究为重组胶原蛋白的工业化生产提供了基础。

重组人乳铁蛋白通过促进成骨细胞增殖加速大鼠骨折愈合

目的研究重组人乳铁蛋白(rhLF)对模型大鼠股骨骨折愈合及大鼠原代成骨细胞增殖的影响。方法将雄性大鼠随机分为3组:单纯骨折组(SF组)、胶原膜处理组(CF组)和rhLF复合胶原膜处理组(CLF组)。通过X线胶片及HE和Masson染色组织学观察比较骨折愈合情况。培养的24 h新生SD大鼠原代成骨细胞以不同浓度rhLF进行处理,MTT法检测成骨细胞增殖。结果CLF组在术后1、2、3周时骨痂较SF组及CF组体积增加更明显(P<0.05),4周时组间对比差异无统计学意义。CLF组软骨痂和硬骨痂增殖更明显,并率先出现成熟骨小梁和板层骨,骨痂成熟度高。与对照组比较,第1天100 mg/L和500 mg/L rhLF组对体外培养的大鼠原代成骨细胞,吸光度(A)值有明显降低(P<0.05)。第5天及第10天时随rhLF浓度增加,A值明显升高(P<0.05)。结论在体内rhLF具有加速骨折愈合作用,表现为骨痂形成快、体积大、成熟度高。它也可以促进体外培养的成骨细胞增殖,主要表现在成骨细胞快速增殖阶段。

基于重组核衣壳蛋白的猪德尔塔冠状病毒间接ELISA检测方法的建立

目的:建立一种关于猪德尔塔冠状病毒(Porcine Deltacoronavirus, PDCoV)抗体的检测方法。方法:对猪德尔塔冠状病毒的核衣壳蛋白(N)进行原核表达,通过Western Blot、SDS-PAGE等方法,对重组蛋白进行鉴定;在获得正确表达的重组蛋白后,以此为抗原,对ELISA反应条件进行优化,并对其特异性、敏感性、重复性进行测试,最终建立ELISA检测方法,并对临床样品进行检测。结果:优化后的抗原包被浓度为2μg/孔,37℃孵育1 h;1%BSA 37℃封闭1 h;一抗稀释最佳浓度为1∶1 600,孵育时间为1 h;酶标二抗最佳孵育时间为60 min。重组蛋白能与猪德尔塔冠状病毒血清发生特异性反应,所建立的检测方法具有优良的敏感性、特异性、重复性。结论:本研究建立了一种针对猪德尔塔冠状病毒的间接ELISA检测方法,为猪德尔塔冠状病毒的抗体水平检测及疾病的防控提供了一种有效的方法。