MYLIP和miR-542-3p与宫颈癌患者早期诊断及临床预后的关系

目的探讨血清肌球蛋白调节轻链相互作用蛋白(MYLIP)和微小RNA-542-3p(miR-542-3p)表达水平对宫颈癌(CC)早期诊断价值及与其临床预后的关系。方法选取本院2018年5月至2020年5月期间收治的128例CC患者作为CC组,另选取同期于本院就诊的86例宫颈上皮瘤变(CIN)患者作为CIN组,行体检的74例体检健康者作为对照组。采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)法检测各组血清MYLIP mRNA和miR-542-3p表达水平,收集CC患者临床病理特征资料,分析二者表达水平与CC患者临床病理特征的关系;使用ENCORI网站预测MYLIP和miR-542-3p之间是否存在靶向关系;使用Pearson法分析MYLIP mRNA和miR-542-3p表达的相关性;绘制受试者工作特征(ROC)曲线评估MYLIP mRNA和miR-542-3p表达水平对CC的早期诊断价值;使用Kaplan-Meier法分析血清MYLIP mRNA和miR-542-3p表达水平与CC患者预后的关系;使用Cox回归分析影响CC患者预后的风险因素。结果CC组血清MYLIP mRNA表达水平显著高于CIN组和对照组(F=118.850,P<0.001),CC组血清miR-542-3p表达水平显著低于CIN组和对照组(F=85.413,P<0.001);CC患者血清MYLIP mRNA和miR-542-3p表达水平与是否绝经(χ^(2)=5.026、6.133)、宫颈浸润深度(χ^(2)=6.767、7.957)、FIGO分期(χ^(2)=7.788、11.480)、TNM分期(χ^(2)=12.426、20.150)、淋巴结是否转移(χ^(2)=8.821、12.687)有关(P<0.05);MYLIP和miR-542-3p存在靶向结合位点,且CC患者血清MYLIP mRNA与miR-542-3p表达为负相关关系(r=-0.415,P<0.001);血清MYLIP mRNA和miR-542-3p表达水平单独及联合诊断CC的曲线下面积(AUC)分别为0.807、0.815、0.894,联合诊断效果优于单独诊断(Z二者联合-MYLIP=2.165、P=0.030;Z二者联合-miR-542-3p=2.360,P=0.018);血清MYLIP mRNA高表达患者3年生存率显著低于低表达患者(52.24%vs.78.69%,χ^(2)=10.869,P=0.001),血清miR-542-3p高表达患者3年生存率显著高于低表达患者(79.03%vs.51.52%,χ^(2)=11.771,P=0.001);MYLIP mRNA高表达(HR=1.972,95%CI:1.565~2.485)是CC患者死亡的危险因素,miR-542-3p高表达(HR=0.517,95%CI:0.399~0.670)是CC患者死亡的保护因素(P<0.05)。结论血清MYLIP mRNA和miR-542-3p表达水平对早期诊断宫颈癌具有一定的价值,且二者表达水平与宫颈癌患者临床预后密切相关。

小鼠肌球蛋白轻链激酶生物信息学分析

目的利用生物信息学方法探讨小鼠肌球蛋白轻链激酶(MYLK)的结构、编码蛋白质的结构及功能等,为研究MYLK蛋白功能调节机制奠定基础。方法通过生物信息学分析,对MYLK基因编码的产物及理化性质、信号肽、跨膜结构、二级结构、三级结构、结构域、亚细胞定位、磷酸化及互相作用蛋白等进行预测分析。结果MYLK由1950个氨基酸组成,为理论等电点为5.92的亲水性不稳定蛋白,无信号肽和跨膜区域,二级结构主要为无规则卷曲,成功构建其三级结构,MYLK蛋白有四种结构域,主要存在于细胞核,有较多的Thr、Ser磷酸化位点,Tyr磷酸化位点相对较少,与MYLK相互作用的蛋白主要是肌球蛋白和钙调蛋白。结论MYLK是具有核定位、无跨膜结构、亲水性不稳定的蛋白质,在细胞黏附、迁移、凋亡等生理活动中具有极为重要的意义。

细胞骨架蛋白肌球蛋白轻链与癌蛋白TRE17相互作用的鉴定

目的:探讨MLC2与TRE17之间的相互作用。方法:构建了MLC2原核表达质粒,在用pGEX蛋白表达系统表达和纯化GST-MLC2和GST蛋白后,用GST Pulldwon方法进一步观察MLC2与TRE17之间的相互作用。结果:限制性内切酶分析和DNA序列测定表明MLC2 cDNA完整ORF以正确的阅读框架插入pGEX-6P-1载体;IPTG诱导表达的GST-MLC2和GST蛋白纯度在90%以上;GST Pulldown分析表明癌蛋白TRE17(447)结合GST-MLC2融合蛋白,而不是对照GST蛋白。结论:MLC2是TRE17的特异性结合蛋白。

癌蛋白PRC17与人肌球蛋白调节轻链相互作用的初步鉴定

目的:分析前列腺癌基因17(PRC17)与人肌球蛋白调节轻链(MLC2)之间的相互作用,并鉴定PRC17蛋白序列上与MLC2相互作用的功能区域。方法:经大肠杆菌表达并用Glutathione Sepharose 4B纯化GST及融合蛋白GST-MLC2,用SMMC-7721细胞表达带HA标签的PRC17及其截短突变体HA-PRC17(353)、HA-PRC17(251)、HA-PRC17(164)和HA-PRC17(Δ164),GST沉淀实验分析GST-MLC2与PRC17及其截短体的相互作用。结果:经诱导表达并纯化的GST和GST-MLC2分子质量符合预期,分别约为28.4 kD和46.6 kD,纯度均95%以上;GST沉淀实验结果显示,PRC17结合MLC2,不结合阴性对照GST;PRC17(353)和PRC17(251)也能有效结合MLC2,但PRC17(164)和PRC17(Δ164)都不能与MLC2结合。结论:PRC17能特异性结合MLC2,其蛋白序列上与MLC2结合的部位位于其氨基端251位氨基酸之内,可能在164位氨基酸附近。

MCAO模型大鼠不同缺血时相、不同脑区Thrombin与LC3Ⅱ/Ⅰ表达的相关性研究

目的研究缺血性中风瘀毒互结模型(简称“IS-YD”)大鼠在不同缺血时相、不同脑区凝血酶(Thrombin)与微管相关蛋白1轻链3(light chain 3,LC3)的动态性变化及二者的相关性。方法将128只SD雄性大鼠随机分为假手术组、IS-YD(2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h、72 h)组,每组16只。分别于术后2、4、8、12、24、48、72 h取材前进行神经功能缺损评分,随即处死大鼠取出脑组织并分出大脑皮质与海马,2,3,5-三苯基氯化四氮唑染色观察并计算每组大鼠的脑梗死体积,Western blot法检测大脑皮质与海马的Thrombin、LC3Ⅱ/Ⅰ比值的表达。结果与假手术组相比,IS-YD 12 h、24 h、48 h组神经功能缺损评分升高(P<0.05)。与假手术组及IS-YD 2 h、4 h组相比,IS-YD 8 h、12 h、24 h、48 h、72 h组脑梗死体积显著增大(P<0.01);与IS-YD 8 h组相比,IS-YD 12 h、24 h、48 h、72 h组脑梗死体积显著增大(P<0.01);与IS-YD 12 h组相比,IS-YD 48 h、72 h组脑梗死体积显著增大(P<0.01);与IS-YD24 h组相比,IS-YD 48 h、72 h组脑梗死体积显著增大(P<0.01);与IS-YD 48 h组相比,IS-YD 72 h组脑梗死体积显著增大(P<0.01)。与假手术组相比,IS-YD 12 h、24 h组皮质和海马Thrombin、LC3Ⅱ/Ⅰ表达显著增强(P<0.05);与IS-YD 2 h、4 h组相比,ISYD 12 h、24 h组皮质和海马Thrombin、LC3Ⅱ/Ⅰ表达显著增强(P<0.05);与IS-YD 8 h组相比,IS-YD 12 h、24 h组皮质LC3Ⅱ/Ⅰ表达显著增强(P<0.01);与IS-YD 12 h组相比,IS-YD 48 h、72 h组皮质Thrombin、LC3Ⅱ/Ⅰ表达显著降低(P<0.05),海马LC3Ⅱ/Ⅰ表达显著降低(P<0.05);与IS-YD 24 h组相比,IS-YD 48 h、72 h组皮质和海马Thrombin、LC3Ⅱ/Ⅰ表达显著降低(P<0.05)。两种蛋白呈现直线相关性,且皮质Thrombin与LC3Ⅱ/Ⅰ的密切程度为56.7%,海马Thrombin、LC3Ⅱ/Ⅰ的密切程度为53.3%。结论脑损伤后Thrombin与自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ在7个不同缺血时间点动态表达规律相似,并且具有高度相关性,同时明确了自噬变化最明显的两个时间点,也为进一步研究治疗脑梗死筛选了最佳药物反应时间点。

核受体辅活化蛋白7与自噬体蛋白LC3的相互作用

目的:探索核受体辅活化蛋白7(nuclear receptor co-activator 7,NCOA7)与微管相关蛋白轻链3(microtubule-associated protein light chain 3,LC3)的相互作用,并确定其结合位点。方法:在胃癌AGS细胞中行质谱分析,在HEK293细胞中行GST-LC3沉淀实验,分别检测两种细胞中LC3结合蛋白;采用分子克隆法构建NCOA7不同截短体和点突变体;免疫印迹法检测NCOA7的截短体ΔN462,ΔN650,ΔN650-I749/750A质粒蛋白的表达水平;GST-LC3与NCOA7突变体的沉淀实验鉴定NCOA7与LC3的结合位点。结果:质谱分析和GST-LC3沉淀实验结果表明,NCOA7是LC3结合蛋白。免疫印迹结果显示,NCOA7不同截短体和点突变体质粒蛋白均有表达。GST-LC3与NCOA7突变体的沉淀结果显示,NCOA7 N端WEDL基序和C端WEII基序是LC3结合位点。WEII基序与LC3结合受到NCOA7的651~720位氨基酸结构抑制,是一个可调节的LC3结合位点。结论:NCOA7是LC3结合蛋白,其N端WEDL和C端WEII与LC3结合。

LncRNA SNHG1通过miR-101-3p/MYLIP轴调节宫颈癌细胞增殖、凋亡和迁移的研究

目的 探究长链非编码RNA(lncRNA)小核仁RNA宿主基因1(SNHG1)对宫颈癌(cervical cancer, CC)细胞增殖、迁移和侵袭的影响及分子机制。方法 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western blot检测人正常宫颈上皮细胞(H8)和人CC细胞(Hela、Caski、C-33A、SiHa)中SNHG1、microRNA-101-3p(miR-101-3p)、肌球蛋白调节轻链相互作用蛋白(MYLIP)的mRNA和蛋白表达。体外培养Hela细胞,使用Lipofectamine 3000试剂将si-SNHG1、anti-miR-101-3p及其阴性对照si-NC、inhibitor-NC转染到Hela细胞中,分为对照(Control)组、si-NC组、si-SNHG1组、si-SNHG1+anti-NC组、si-SNHG1+anti-miR-101-3p组。转染48 h后,qRT-PCR检测细胞中SNHG1、miR-101-3p和MYLIP mRNA的表达水平,Western blot检测细胞中MYLIP蛋白表达;CCK-8法检测细胞增殖活力,流式细胞术检测细胞凋亡,Transwell小室实验检测细胞迁移、侵袭能力;通过双荧光素酶报告(DLRA)和RNA结合蛋白免疫沉淀(RIP)实验验证Hela细胞中SNHG1、miR-101-3p和MYLIP的调控作用。结果 CC细胞系(Hela、Caski、C-33A、SiHa)中SNHG1、MYLIP mRNA和蛋白水平升高,miR-101-3p表达水平降低(P<0.05)。敲低SNHG1可显著上调miR-101-3p表达,降低MYLIP表达,抑制Hela细胞增殖、迁移和侵袭,并促进Hela细胞凋亡(均P<0.05);下调miR-101-3p可显著减弱SNHG1敲低的促凋亡和抗迁移、侵袭作用(均P<0.05)。DLRA和RIP实验证实SNHG1可以靶向并结合Hela细胞中的miR-101-3p, MYLIP是miR-101-3p的靶标。结论 SNHG1敲低可能是通过上调miR-101-3p来抑制MYLIP表达,进而抑制CC细胞增殖、迁移和侵袭,并促进CC细胞凋亡。

铁蛋白结构和功能的生物信息学分析

[目的]通过生物信息学方法探究铁蛋白的结构和功能的相关信息,研究铁蛋白与肝癌的潜在关系。[方法]从NCBI获取铁蛋白序列,分别使用ProScale、TMHMM、NCBI-CDD和Prosite工具分析铁蛋白的亲疏水性、跨膜区、功能结构域和生物活性位点。使用SOPMA、PSIPRED和SWISS-MODEL平台预测了铁蛋白的二级结构和三级结构。进一步,基于STRING数据库研究了铁蛋白的互作蛋白和富集通路。[结果]铁蛋白是一种亲水性蛋白,无跨膜区,存在1个铁蛋白样二铁氧化的功能结构域和2个生物活性位点,具有较高的螺旋程度。铁蛋白与RPS17、TFRC、SCARA5、NCOA4和COX8A五种蛋白相互作用,这些蛋白显著富集在铁死亡与矿物吸收富集途径,与癌症的发生有关。[结论]对铁蛋白进行生物信息学分析,预测了铁蛋白重链和轻链的理化性质和空间结构,也从其功能上揭示了与肝癌的潜在关系,为深入研究提供了理论基础。

UVB诱导A375细胞自噬与凋亡调控机制探讨

目的探究中波紫外线(UVB)对人表皮黑色素瘤细胞株A375细胞自噬与凋亡的诱导效应。方法 (1)取对数生长期A375细胞,分别予剂量为10.0、15.0 m J/cm^2的UVB照射,于照射后3、6、9、12 h收集细胞,用单丹磺酰戊二胺染色法观察细胞自噬,用吖啶橙/溴乙锭染色法观察细胞凋亡。(2)予相应剂量的UVB照射10.0、15.0 m J/cm^2组A375细胞,于照射后18、24、36、48 h收集细胞,以CCK-8法检测细胞存活率。(3)予剂量为10.0、15.0 m J/cm^2的UVB照射A375细胞,于照射后3、6、9、12 h收集细胞;予剂量为2.5、5.0、7.5、10.0、15.0 m J/cm^2的UVB照射A375细胞,于照射后9 h收集细胞;用免疫印迹法检测B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、Bcl-2相互作用蛋白(Beclin-1)、微管相关蛋白1轻链3(LC3)Ⅱ的表达。上述3个实验均另设不予UVB照射(予假照射)的对照组。结果 (1)剂量为10.0、15.0 m J/cm^2的UVB照射诱导的A375细胞自噬和细胞凋亡均表现为随着照射后时间的延长而增强,但在15.0 m J/cm^2UVB照射后12 h,细胞自噬已观察到降低。(2)10.0、15.0 m J/cm^2组细胞活力均随照射后时间的推移而增加(P<0.05);在照射后18~48 h,10.0和15.0 m J/cm^2组细胞活力均低于对照组(P<0.05);在照射后24~48 h,15.0 m J/cm^2组细胞活力均低于10.0 m J/cm^2组(P<0.05)。(3)10.0 m J/cm^2组细胞Beclin-1和LC3Ⅱ蛋白相对表达水平在照射后0~12 h内均随照射时间的增加而增加(P<0.05),而15.0 m J/cm^2组细胞仅在照射后0~9 h内观察到上述改变,在12 h时间点上述2个自噬相关蛋白明显下降(P<0.05);10.0和15.0 m J/cm^2组细胞Bcl-2蛋白相对表达水平在照射后3~12 h内均随照射时间的增加而下降(P<0.05),Bax蛋白相对表达水平均在照射后0~12 h内随照射时间的增加而增加(P<0.05)。0.0~10.0 m J/cm^2组细胞Beclin-1和LC3Ⅱ蛋白相对表达水平,0.0~15.0 m J/cm^2组细胞Bax蛋白相对表达水平,均随照射剂量的增加而增加(P<0.05);5.0~15.0 m J/cm^2组Bcl-2蛋白相对表达水平随照射剂量的增加而下降(P<0.05)。结论剂量为10.0和15.0 m J/cm^2UVB照射均可诱导A375细胞发生自噬和凋亡;10.0 m J/cm^2UVB照射诱导的细胞自噬可部分抵抗UVB对凋亡的诱导而使细胞活力增强,15.0 m J/cm^2UVB诱导的自噬不足以发挥上述作用,且以诱导凋亡为主导效应。

形态学检测在自噬研究中的应用

自噬是降解损伤及丧失功能的细胞器或蛋白,维持细胞更新和稳态的关键细胞过程。自噬可分为三个相对独立的步骤:自噬泡起始形成阶段、自噬小体形成阶段以及成熟降解阶段,每个阶段都有其相对独特的形态学特征或分子标志物变化。本文综述了自噬研究中常用的形态学研究方法、结果阐释及这些过程中的关键注意事项。

自噬相关因子在结直肠腺癌中的表达及其与临床病理参数间的关系

目的探讨结直肠腺癌中自噬相关因子Unc-51样自噬激活激酶1(ULK1)、B细胞淋巴瘤2基因作用蛋白(Beclin1)、自噬标志物轻链3(LC3)的表达情况及其与临床病理参数的相关性。方法收集贵州医科大学附属医院病理科2020年1—12月资料完整的结直肠癌根治术标本共63例。采用免疫组化EnVision法检测肿瘤组织及相应癌旁组织中ULK1、Beclin1及LC3的蛋白表达情况,分析三者与患者年龄、性别、原发部位、神经侵犯、分化程度、淋巴结转移等临床病理资料的相关性。结果自噬相关蛋白ULK1、Beclin1、LC3主要表达于细胞质。与正常组织相比,肠腺癌组织中ULK1(71.43%vs.44.44%)、Beclin1(66.66%vs.47.61%)、LC3(55.55%vs.30.15%)蛋白表达水平均明显升高(均P<0.05)。ULK1与肿瘤分化程度相关(P<0.05),而Beclin1和LC3在肿瘤组织和正常组织之间差异无统计学意义(均P>0.05)。三者与患者的年龄、性别、原发部位、大体类型、神经侵犯均无相关性。此外,ULK1、LC3与淋巴结转移有相关性(均P<0.05),而Beclin1与淋巴结转移无相关性(P>0.05)。结论结直肠癌中自噬相关蛋白表达水平增高,ULK1与组织分化程度相关;部分蛋白表达水平与有无淋巴结转移相关,提示自噬在结直肠腺癌中的表达增高可能是癌组织致病、转移的机制之一。对肿瘤组织自噬途径的干预,可能会解决结直肠癌复发和转移的一些问题。