牛膝醇提物诱导兔骨髓间充质干细胞软骨分化的蛋白组学分析

背景:前期研究发现牛膝醇提物具有诱导骨髓间充质干细胞定向软骨细胞分化的作用,但具体作用蛋白靶点和网络机制不详。目的:观察牛膝醇提物诱导兔骨髓间充质干细胞软骨分化的蛋白质组学分析及蛋白质相互作用网络构建。方法:采用密度梯度离心联合细胞贴壁法分离培养新西兰大白兔骨髓间充质干细胞,取第3代细胞随机分成5组:空白组、对照组、牛膝醇提物低、中、高剂量组,连续成软骨诱导培养21 d后,用qRT-PCR检测Ⅱ型胶原mRNA表达及甲苯胺蓝染色鉴定软骨细胞形成,应用绝对定量同位素标记(iTRAQ)结合双向液相色谱-串联质谱(2DLC-MS/MS)技术对各组差异表达蛋白质进行鉴定,并对差异蛋白进行GO分析、KEGG分析及蛋白质网络相互作用分析。结果与结论:(1)qRT-PCR结果显示牛膝醇提物高剂量组较其他组Ⅱ型胶原mRNA表达明显增高(P<0.05),牛膝醇提物高剂量组甲苯胺蓝染色阳性,蛋白组学分析共鉴定到1354个差异蛋白点,上调蛋白633个,下调蛋白721个。(2)根据qRT-PCR结果对空白组、牛膝醇提物高剂量组、对照组3组差异表达蛋白进行生物信息分析。GO分析发现这些差异表达蛋白参与代谢、细胞分化、细胞周期与凋亡、炎症反应、免疫调控、氧化应激、磷酸化、泛素化、癌相关等;KEGG分析获得与骨关节病最相关的10个典型信号通路:白细胞介素17信号通路,Toll样受体信号通路,Wnt信号通路,PI3K-Akt信号通路,mTOR信号通路,Jak-STAT信号通路,NF-kappa B信号通路,MAPK信号通路,AMPK信号通路,HIF-1信号通路;根据组间差异蛋白,使用Cytoscape3.6.0软件成功构建蛋白互作网络图。(3)结果表明,牛膝醇提物可以通过调控氧化、细胞周期与凋亡、细胞结构改变、细胞分化、代谢及炎症损伤等环节诱导兔骨髓间充质干细胞成软骨分化,具有多靶点、多中心的网络调控作用,其具体作用机制有待进一步研究。

牛膝醇提物经皮透入治疗骨质疏松症的临床研究

目的:观察牛膝醇提物经皮透入治疗骨质疏松症的临床疗效。方法:选取2019年10月—2021年10月深圳市罗湖区中医院收治的经中医辨证分型属肾虚血瘀型诊断为原发性骨质疏松的患者60例,按就诊先后次序随机分为两组:治疗组30例,应用牛膝醇提物经皮透入加碳酸钙D3片口服治疗;对照组30例,单纯应用碳酸钙D3片口服治疗。比较两组患者不同治疗时间节点的骨密度(BMD)、腰椎T值、髋部T值以及Ⅰ型前胶原氨基端前肽(PINP)、骨钙素(BGP)、骨特异性碱性磷酸酶(BLAP)等骨代谢指标。结果:治疗前,两组BMD、腰椎T值、髋部T值、PINP、BGP、BLAP差异无统计学意义(P>0.05)。治疗后6、12个月,治疗组的BMD、腰椎T值、髋部T值、PINP、BGP、BLAP与治疗前差异有统计学意义(P<0.01),对照组上述指标与治疗前差异无统计学意义(P>0.05);治疗组与对照组的上述指标差异有统计学意义(P<0.01)。结论:牛膝醇提物经皮透入治疗骨质疏松症对比单纯西药治疗具有更好的临床疗效,值得在临床进一步推广应用。

怀牛膝多糖的提取及应用

怀牛膝多糖是从怀牛膝中提取、分离、纯化得到的一种小分子水溶性多糖化合物,具有抗肿瘤、增强免疫功能、抗凝血、抗病毒、改善骨质疏松、促进骨骼发育、抗氧化、抗衰老等效用,已成为重要的多糖药物之一,在临床应用和保健品中具有很大的开发潜力。对怀牛膝多糖的提取工艺及应用现状进行了系统深入的研究,并对其未来的进一步研究提出了可行性建议。

响应面法优化牛膝多糖的微波法提取工艺研究

采用响应面法优化微波提取怀牛膝多糖的条件。在单因素试验的基础上,选取微波提取功率、提取时间、料液比和提取次数为影响因子,应用Box-behnken中心组合进行四因素三水平的试验设计,以怀牛膝多糖得率作为响应值,进行响应面分析(RSM)。结果表明,微波法提取多糖的最佳工艺参数为提取功率800 W,提取时间2.5 min,料液比1∶30(g∶mL),提取次数2次,模型预测值为29.38%,实际测得多糖得率为29.40%,与模型预测值的相对误差为0.07%,模型预测值为与模型预测值基本相符。微波辅助法适用于提取怀牛膝多糖。

怀牛膝多糖的超声波辅助提取工艺及其抗氧化性活性

研究怀牛膝多糖的超声波提取工艺和抗氧化性。在单因素实验基础上采用正交实验得出超声波提取怀牛膝多糖的适宜工艺条件,即超声波功率1 000 W、提取温度60℃、提取时间60 min、料液比(g∶mL)1∶30。在此提取工艺条件下,粗多糖得率为6.1%。体外抗氧化性实验表明,所提取怀牛膝多糖具有较好的抗氧化性,对H2O2、O2-.和.OH的清除率分别可达到75.1%、90.3%和61.3%。

15种中草药提取液对怀牛膝根结线虫的杀虫杀卵效果

利用15种中草药水溶性提取液对怀牛膝根结线虫二龄幼虫及卵进行室内离体活性测定。结果表明,供试的15种中草药提取液对怀牛膝根结线虫幼虫和卵的毒杀活性差异显著,其中,用徐长卿、黄姜、喜树、藜芦提取液处理后,二龄幼虫72h的校正死亡率分别为95.46%、95.00%、91.79%、90.47%,杀线虫活性强度均达到"++++",1～30d卵的孵化抑制率分别为94.30%、94.13%、90.89%、91.13%,卵的校正死亡率分别为80.40%、82.23%、75.54%、78.87%。徐长卿、黄姜、喜树、藜芦提取液对怀牛膝根结线虫的杀虫、杀卵效果较好。

超声提取-反相高效液相色谱法测定牛膝中蜕皮甾酮

比较了超声提取与回流提取法在提取牛膝中活性成分蜕皮甾酮的提取效率 ,在频率为 110 0 k Hz时超声提取 4 0 min可获得稳定的提取效率。采用 Shim- Pack CL C- ODS色谱柱 ,甲醇∶水 =4 0∶ 6 0 (V/ V,% )为流动相 ,在波长 2 4 8nm下 ,测定牛膝中蜕皮甾酮 ,线性范围为 2— 2 0 0 μg/ m L(r=0 .9998) ,检出限为0 .0 5 2μg/ m L (S/ n=3) ,加标回收率为 98.3%— 10 3%。

大孔吸附树脂提取分离牛膝总甾酮

对大孔吸附树脂提取分离牛膝总甾酮的吸附和洗脱性能进行了研究。结果表明,D型大孔吸附树脂对牛膝总甾酮的吸附量为28 9mg/g;在pH=2～10,吸附流速<1 2BV(BV:树脂柱床体积)/min,用φ(C2H5OH)=85%的乙醇2BV,牛膝总甾酮就可以被完全洗脱;经D型大孔吸附树脂提取分离后,提取物中总甾酮质量分数可达到60%,蜕皮甾酮质量分数可达到10%以上,说明大孔吸附树脂提取分离牛膝总甾酮的方法可行。

牛膝正丁醇萃取物对小鼠繁殖性能的影响

用不同剂量(0.5,2.0,4.0 g/kg)牛膝正丁醇萃取物给配对前的成年小鼠连续灌喂15 d,检测部分雄鼠精液品质、睾丸发育情况和内脏器官;同时在雌、雄小鼠合笼后观察小鼠妊娠及胚胎发育情况,以探讨牛膝正丁醇萃取物对成年小鼠繁殖性能的影响。结果表明,牛膝正丁醇萃取物不能明显干扰小鼠的繁殖性能,小鼠可以正常发情、妊娠,且胎儿发育正常,仅4.0 g/kg剂量处理组母鼠的胎仔数与其他各组相比差异显著(P<0.05)。2和4g/kg灌喂剂量可引起小鼠脾脏、肝脏、肾脏出现急性炎症反应。

响应面分析方法优化怀牛膝药材超声提取工艺研究

目的优化怀牛膝药材β-蜕皮甾酮的超声提取工艺。方法以单因素研究为基础,以怀牛膝中β-蜕皮甾酮为响应值,以三因素三水平的响应面分析法优化怀牛膝中β-蜕皮甾酮的提取工艺。结果怀牛膝β-蜕皮甾酮的最优提取工艺条件为:正丁醇45%,液料比:15∶1,提取时间1.7 h。在该条件下,怀牛膝中提取量预测值为5.17 mg/g,实际验证值为5.29 mg/g,并得出各因素对怀牛膝β-蜕皮甾酮提取量的影响大小依次为:正丁醇体积分数(A)>液料比(B)>提取时间(C)。结论响应面分析法优化怀牛膝β-蜕皮甾酮的提取工艺稳定可行。

牛膝中齐墩果酸的提取工艺研究

目的 :筛选牛膝中齐墩果酸的最佳提取工艺。方法 :采用正交设计L1 8(37) ,用高效液相色谱法对不同提取工艺牛膝中的齐墩果酸的含量进行测定。结果 :牛膝中齐墩果酸的最佳提取工艺为A1 B2 C1 D1 ,即 2 0目的药材 ,加入 70 %的乙醇水浴回流提取 1h 。

牛膝中三萜皂苷的富集工艺研究

目的系统研究牛膝中齐墩果酸皂苷及其富集工艺。方法采用UV方法确定牛膝中齐墩果酸的最佳的提取方法,利用大孔树脂研究了齐墩果酸皂苷的吸附与解吸附作用,优化了大孔树脂富集纯化齐墩果酸皂苷的工艺。利用比较合适的齐墩果酸-28-葡萄糖苷为标准品,建立了紫外显色法测定齐墩果酸总皂苷含量的方法。结果牛膝中齐墩果酸皂苷的最佳提取条件为70%乙醇提取回流2h。利用HP-20大孔树脂处理以及采用新的标准品为对照,提取物中总皂苷含量可提高到64.65%。结论利用齐墩果酸-28-葡萄糖苷为标准品,HP-20富集、纯化牛膝总皂苷是可行的。

牛膝多糖的提取与含量测定

以水提醇沉法从牛膝中提取得到牛膝多糖,采用苯酚-硫酸法测定其多糖含量,以正交实验优化显色条件。确定5苯酚用量1.0mL,浓硫酸用量7.5mL,反应时间30min。标准曲线回归方程为A=0.0572C-0.0069,r=0.9991(n=7),在2.5～30.0mg/L范围内呈良好线性关系。平均回收率为97.5,RSD=1.69(n=5)。测得多糖平均含量为29.4,RSD=1.84(n=6)。该法简单、准确、稳定,可为其继续研究开发及应用提供参考依据。

牛膝高分子物质的细胞毒性及其组成的初步研究

目的：研究牛膝对Ｐ３８８白血病细胞的体外细胞毒性及其活性成分。方法：牛膝根以水提取，经Ｔｏｙｏｐｅａｒ１ＨＷ－４０Ｃ凝胶过滤，得到高分子物质部分。以Ｐ３８８白血病细胞的体外培养确定细胞毒活性。以ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ－２００进行分离和纯化。以１Ｈ－ＮＭＲ进行初步的组成鉴定。结果：牛膝水提取物的高分子物质部分有细胞毒性，ＩＣ５０值为５．２μｇ·ｍｌ－１。多糖为其主要成分，由木糖、甘露糖和果糖等单糖做成。结论：牛膝水提取物的高分子物质部分对Ｐ３８８白血病细胞有显著的体外细胞毒性。多糖可能是细胞毒性成分。

超声波辅助提取牛膝多糖的工艺研究

采用超声波辅助提取法对牛膝中水溶性多糖的提取工艺进行了研究。考察了料液比、超声时间、提取温度、醇沉浓度等四个因素对牛膝多糖提取效果的影响。通过正交试验得出超声提取的最佳工艺条件为:料液比1∶50、超声时间50 min、提取温度50℃、醇沉浓度90%,此时多糖得率达到11.7%,结果可为牛膝多糖的深入研究提供一定的依据。

牛膝醇提物干预BMSC-Exos对OA模型兔局部骨组织超微结构及炎症小体的影响

目的:观察牛膝醇提物含药血清培养的骨髓间充质干细胞来源外泌体对实验兔骨关节炎模型关节局部骨组织超微结构及炎症小体的影响。方法:将20只健康实验兔按照随机数字表法分为空白组、模型组及牛膝醇提物低、中、高剂量组,每组4只,分别予等量蒸馏水及牛膝醇提物低、中、高剂量灌胃1周后采血制备含药血清,用牛膝醇提物不同浓度含药血清连续培养骨髓间充质干细胞7 d,在第7天时从骨髓间充质干细胞上清液中提取外泌体,再将外泌体通过关节穿刺的方法注射到不同组别兔膝骨关节炎模型内,1次/周,连用3周,注射第6周后进行膝关节软骨组织病理HE染色、关节活动度评分及关节粘连改善度评分,用microCT检测膝关节局部周围骨组织超微结构及骨量,采用qRT-PCR检测滑膜组织中炎症小体关键分子NLRP3 mRNA、Caspase-1 mRNA、Toll4 mRNA、NF-κB mRNA表达水平。结果:实验兔膝关节腔注射外泌体后第6周,与模型组比较,低、中、高剂量组兔膝关节活动度和粘连改善度评分均明显升高(P<0.01),且与剂量呈正相关。模型组兔膝关节软骨基质染色变浅,软骨细胞数量明显减少,关节面凹凸不平,血管入侵潮线结构;低、中、高剂量组兔膝关节软骨基质染色逐渐恢复正常,软骨细胞数量较模型组增多,软骨细胞呈卵圆形,关节面恢复平整,潮线结构依次恢复正常。microCT检测提示,与模型组比较,低、中、高剂量组兔膝关节的Mean、BMD、Conn.Dn.、BV/TV均明显升高(P<0.05),BS均明显降低(P<0.05),而BS/BV、BS/TV、Tb.N、Tb.Sp、DA组间比较,差异均无统计学意义(P>0.05),其中Mean、BMD、Conn.Dn.、BV/TV、BS与剂量呈相关性。qRT-PCR检测结果显示,模型组兔滑膜组织NLRP3 mRNA、Caspase-1 mRNA、Toll4mRNA、NF-κB mRNA相对表达量均明显高于空白组(P<0.01),低、中、高剂量组兔滑膜组织NLRP3 mRNA、Caspase-1 mRNA、Toll4 mRNA、NF-κB mRNA相对表达量均明显低于模型组(P<0.05),且与剂量呈正相关。结论:牛膝醇提物能改善OA模型兔局部骨组织骨含量及骨微结构,能降低炎症小体通路关键分子NLRP3 mRNA、Caspase-1mRNA、Toll4 mRNA、NF-κB mRNA表达。

中草药提取物对怀牛膝根结线虫的田间药效

为了替代高毒性、高残留的化学杀线剂,研究了黄姜、徐长卿、藜芦、喜树4种中草药提取物对怀牛膝根结线虫的田间防治效果。结果表明,黄姜和徐长卿提取物防治效果较好,根结减少率分别达到88.87%和86.66%,病级下降了3级以上,根长增长率为66.58%和62.18%,根鲜质量增长率为92.55%和93.23%,株高增长率为73.01%和73.64%,地上部鲜质量增长率为82.35%和81.09%,产量及齐墩果酸含量相比对照(水)也极显著提高。研究还发现,怀牛膝根结数与主根根长、根鲜质量、株高、地上部鲜质量、产量均呈极显著的负相关。总之,根结线虫会严重影响怀牛膝的生长发育,应用4种中草药提取物均能够有效防治怀牛膝根结线虫病。

基于多组学整合分析牛膝醇提物诱导兔骨髓间充质干细胞软骨分化的生物网络机制研究

目的:观察牛膝醇提物诱导兔骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)软骨分化的多组学生物网络机制。方法:将12只实验兔随机分为空白组、牛膝醇提物组、阳性对照组,每组4只,制备含药血清。再用密度梯度离心联合骨髓贴壁法分离培养兔BMSCs,取P3代细胞随机分成3组:空白组、牛膝醇提物组、阳性对照组,用不同组别含药血清连续诱导培养21 d后,用同位素标记相对和绝对定量(Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantification,iTRAQ)结合双向液相色谱-串联质谱技术测定不同组别差异表达蛋白质,用转录组测序筛选不同组别差异表达基因。采用生物信息学进行三组整合韦恩分析、基因本体论(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析及网络拓扑学分析,并构建生物网络蛋白质-蛋白质相互作用图。结果:韦恩分析显示牛膝醇提物组vs.空白组共有14个蛋白/基因,阳性对照组vs.空白组共有48个蛋白/基因,阳性对照组vs.牛膝醇提物组共有25个蛋白/基因;富集分析显示牛膝醇提物组vs.空白组共富集到7个GO功能或KEGG通路,阳性对照组vs.空白组共富集到21个GO功能或KEGG通路,阳性对照组vs.牛膝醇提物组共富集到10个GO功能或KEGG通路;网络拓扑学分析显示在网络中节点3种网络拓扑性质计算得分Top10的节点基因方面,牛膝醇提物组vs.空白组是ISG15、HSPA5、HYOU1、HSP90B1、ERO1A、MANF、SLC3A2、DDX58、PRKRA、RAB39B,阳性对照组vs.空白组是HSPA5、HSP90B1、PDIA4、CTSB、VCL、LDHA、HYOU1、PHGDH、LGALS3、TFRC,阳性对照组vs.牛膝醇提物组是LGALS3、CTSB、FABP4、ANPEP、HP、ACAN、CD9、TFRC、LCP1、NID2。结论:牛膝醇提物诱导兔BMSCs成软骨分化具有多靶点、多中心的网络调控作用,其具体的作用机制有待进一步验证研究。

牛膝蜕皮甾酮的加速溶剂提取法研究

目的采用加速溶剂提取法提取牛膝中的蜕皮甾酮,探讨其在中药质量控制中应用的可行性.方法以蜕皮甾酮为指标成分,采用RP-HPLC为检测方法,单因素考察法对影响加速溶剂提取牛膝中的蜕皮甾酮的因素进行考察.结果优选出了牛膝中蜕皮甾酮加速溶剂提取的最佳条件:以无水甲醇为溶剂,药材的粒径为0.3～0.45mm,提取温度为100℃,提取压力10.34 MPa,提取时间6 min,提取1次.结论加速溶剂提取技术能够快速高效地提取牛膝中的蜕皮甾酮.

怀牛膝多糖的提取分离及生物活性研究进展

怀牛膝,“四大怀药”之一,是一种珍贵的中国传统药材。近年来,多糖作为广泛存在于微生物、动植物的生物大分子被报道具有多种生物活性而受到学者们的关注。本文综述了国内外有关怀牛膝多糖的分离、提取、含量测定和生物活性等方面的研究成果。为进一步研究、开发和应用怀牛膝多糖在功能性食品及治疗剂领域提供科学依据与基础。