丙型肝炎病毒5’NCR转基因细胞模型及在反义核酸药物筛选和评价中的应用

为了进行以基因为靶的抗丙型肝炎病毒(HCV)药物的筛选及评价,将HCV5＇NCR-C基因与荧光素酶基因的融合基因片段插入pCI-neo表达载体,通过PCR扩增、酶切反应及荧光素酶瞬间表达活性鉴定,获得HCV 5＇NCR调控荧光素酶的稳定表达质粒pHCV-neo4,将其转染HepG2细胞,经C418筛选,从150个克隆中获得一个高荧光素酶活性表达的细胞株HepG2.9706.该株细胞内HCV片段的DNA及mRNA检测均呈阳性,转基因拷贝数为140.利用该细胞株,通过脂质体介导,对3条针对HCV调控基因的反义寡核苷酸(ASODNs)即HCV363,HCV349,HCV279进行了活性评价,结果显示,三种ASODNs均具有特异性的剂量依赖性抑制活性,浓度在0.5μmol/L时,三者对HCV 5＇NCR调控荧光素酶表达抑制率分别为61％,55％及48％.该研究提示反义寡核苷酸有可能成为治疗HCV的新途径.

猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)CH-1a株非结构基因的分子克隆及其基因特征的研究

本研究对猪生殖－呼吸道综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）的非结构基因，包括ＯＲＦ１基因、５’端非编码区基因（Ｎｏｎ－ＣｏｄｉｎｇＲｉｇｏｎ，ＮＣＲ）和３’端非编码区基因（ＮＣＲ）分别进行了分子克隆和测序，并对其基因特征作了研究分析。结果表明，ＰＲＲＳＶ－ＣＨ－１ａ株ＯＲＦ１ａ起始密码子上游是由保守序列５’ＵＵＡＡＣＣ３’连接的５’ＮＣＲ，在该区附近的约４３个碱基有较高的保守性，其余核苷酸的变异较大。ＯＲＦ１ａ编码的多聚蛋白又可切割生成六个非结构蛋白（Ｎｓｐ１ａ、Ｎｓｐ１β、Ｎｓｐ２－５），其中Ｎｓｐ２可能具有型特异性，在不同基因型的ＰＲＲＳＶ分离株之间表现出较大的变异，和ＶＲ２３３２株的ＮｓＰ２的编码基因相比有８６％的同源性，同ＬＶ株只有４５％的同源性；ＯＲＦ１ｂ所编码的聚合蛋白经切割后形成四个非结构蛋白（ＲｄＲｐ、ＣＰ２－４），同 ＯＲＦ１ａ所编码的蛋白相比较为保守，但是，在ＣＰ４的Ｃ端仍有较大的变异，其编码区和ＶＲ２３３２株相比有８８．７％的同源性，而和ＬＶ株只有５３．４％的同源性。ＣＨ－１ａ株的ＯＲＦ１ａ－ＯＲＦ１ｂ的衔接区为核糖体移码区，在所有的ＰＲＲＳＶ分离株中高度保守。

乙型肝炎病毒感染者和静脉吸毒人员血清HGV RNA的检测初探

为了解庚型肝炎病毒不同基因区的检测情况,我们利用1990年和现年收集各47例和57例HBsAg携带者的冻存血清及15例静脉吸毒人员的血清进行HGV NS3区RT-PCR检测,NS3区阳性者再以5′NCR区检测,现将结果报告如下。

基于膜显色结果判读的基因芯片快速检测丙型肝炎基因型方法的研究

目的 研制一种新型基于膜显色的芯片,用于丙型肝炎病毒(HCV)及其基因分型的快速检测。方法 根据HCV 5′端非编码区(5′NCR)设计特异型探针和引物,制作DNA芯片。实验组为60份HCVRNA阳性血清,对照组为20份健康人血清。获得目的片段后与芯片杂交,通过尼龙膜上的显色信息判读基因型。同时以测序法进行双盲HCV基因分型对照检测。 结果 实验组HCV芯片检测结果均为阳性,对照组均为阴性。实验组基因分型检测结果与测序结果两者符合率为96.7％。 结论 用DNA芯片来检测HCV基因分型具有快速、高特异性和高灵敏度的特性,可以应用于HCV及其基因分型临床检测。