枸杞多糖调节Nrf2/HO-1/GPX4铁死亡途径对妊娠期糖尿病大鼠胰岛素抵抗的改善作用

目的 探讨枸杞多糖调节Nrf2/HO-1/GPX4铁死亡途径对妊娠期糖尿病(GDM)大鼠胰岛素抵抗的改善作用。方法 将SD成年大鼠雌雄合笼得到孕鼠,建立GDM模型,随机分为模型组,枸杞多糖低、中、高剂量组,ferrostatin-1组,每组8只,另设对照组,腹腔注射等剂量柠檬酸缓冲液。末次给药24 h后,检测大鼠FBG、FINS、IRI水平。再次复制GDM模型32只,随机分为模型组、枸杞多糖组、ML385组、枸杞多糖+ML385组,另设对照组。药物分组干预后,检测大鼠FBG、FINS、IRI、TG、TC水平,妊娠第19天检测母体及胎鼠体质量以及血清IL-18、IL-6、SOD、MDA水平,子宫内膜组织ACSL4、PTGS2、Nrf2/HO-1/GPX4通路蛋白表达。结果 与对照组比较,模型组大鼠FBG、FINS、IRI,母体及胎鼠体质量,血清TG、TC、IL-18、IL-6、MDA水平,子宫内膜组织ACSL4、PTGS2蛋白表达升高(P<0.05),血清SOD水平、子宫内膜组织Nrf2、HO-1、GPX4蛋白表达降低(P<0.05);与枸杞多糖+ML385组比较,枸杞多糖组大鼠FBG、FINS、IRI,母体及胎鼠体质量,血清TG、TC、IL-18、IL-6、MDA水平,子宫内膜组织ACSL4、PTGS2蛋白表达降低(P<0.05),血清SOD、子宫内膜组织Nrf2、HO-1、GPX4蛋白表达升高(P<0.05)。结论 枸杞多糖可通过促进Nrf2/HO-1/GPX4信号传导,抑制铁死亡途径,降低GDM大鼠血糖血脂水平,减弱其胰岛素抵抗。

基于Nrf2-HO-1/GPX4信号轴探讨中药靛玉红衍生物E804抑制肺癌A549细胞增殖和迁移的作用机制

目的 探讨中药靛玉红衍生物E804对非小细胞肺癌(NSCLC)系A549细胞增殖和迁移的影响,并阐明Nrf2-HO-1/GPX4信号轴可能的作用机制。方法 以肺癌A549细胞为细胞模型。采用MTT和细胞划痕实验观察0、10μmol/L E804和10μmol/L E804+不同特异性抑制剂(Nec-1、CQ、Z-VAD、DFO、Fer-1和Lip-1)组细胞的增殖和迁移能力;采用DCFH-DA荧光探针法检测0、2.5、5和10μmol/LE804组细胞内活性氧(ROS)含量,比色法检测二价铁离子(Fe^(2+))含量,分光光度法检测还原型谷胱甘肽(GSH)含量,微量法检测丙二醛(MDA)含量;Western blot法检测0、2.5、5和10μmol/L E804组细胞SLC7A11、Transferrin、GPX4、SLC40A1、Nrf2和HO-1蛋白表达水平。结果 与对照组(0μmol/LE804)比较,2.5、5和10μmol/L E804升高细胞内ROS、Fe^(2+)和MDA水平,降低细胞内GSH含量(P<0.01),同时降低SLC7A11、GPX4、SLC40A1、Nrf2和HO-1蛋白表达水平(P<0.01),升高Transferrin表达水平(P<0.05)。与单独使用10μmol/LE804组比较,细胞凋亡抑制剂(Z-VAD)组和细胞铁死亡抑制剂(DFO、Fer-1和Lip-1)组能够部分逆转E804对A549细胞的增殖和迁移抑制(P<0.01)。结论 E804可抑制A549细胞增殖和迁移,并诱发铁死亡,其机制可能与抑制Nrf2-HO-1/GPX4信号轴有关。

疏肝补肾毓麟汤通过Keap1/Nrf2/GPX4通路抑制睾丸细胞铁死亡改善肝郁肾虚型少弱精子症小鼠的精子质量

目的探讨疏肝补肾毓麟汤改善肝郁肾虚型少弱精子症小鼠生精功能和精子质量的作用及其可能机制。方法60只雄性KM小鼠,随机分为空白组、模型组、疏肝补肾毓麟汤高、中、低剂量组和司他丁-1(Ferrostatin-1,Fer-1)组(Fer-1是铁死亡抑制剂)。除空白组外,其余组以1.25 g·kg^(-1)腺嘌呤灌胃(Intragastrical administration,ig.)+慢性束缚刺激构建肝郁肾虚型少弱精子症小鼠模型。给予相应药物干预后:精密天平称取小鼠体质量、睾丸质量、附睾质量计算睾丸指数、附睾指数;苏木素-伊红(Hematoxylin-eosin staining,HE)染色观察睾丸组织病理变化并对睾丸生精功能进行评分;全自动精子分析仪检测精子密度和活动率;苯胺蓝染色法观察精子成熟度;布鲁斯蓝染色法观察睾丸组织铁沉积;免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)检测睾丸组织谷胱甘肽过氧化物酶4(Glutathione peroxidase 4,GPX4)、溶质载体家族7成员11(Recombinant Solute Carrier Family 7 Member 11,SLC7A11)蛋白表达;生化法检测睾丸组织超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量;蛋白免疫印迹法(Western Blot,WB)检测睾丸组织Kelch-样ECH相关蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein-1,Keap1)、核因子E2相关因子2(Nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2)、GPX4、SLC7A11蛋白表达。结果与空白组比较,模型组小鼠睾丸指数、附睾指数、睾丸生精功能、精子密度及活动率、精子成熟度均显著下降(P<0.05,P<0.01);经疏肝补肾毓麟汤及Fer-1干预后,上述指标均有显著改善(P<0.05,P<0.01),且睾丸组织铁沉积显著降低,Keap1表达显著降低,Nrf2、SLC7A11、GPX4表达显著升高(P<0.05,P<0.01)。结论疏肝补肾毓麟汤能明显改善肝郁肾虚型少弱精子症,其机制可能与调控Keap1/Nrf2/GPX4信号通路抑制睾丸细胞铁死亡有关。

干预自噬调控p62-Keap1/Nrf2-GPX4通路对结直肠癌细胞铁死亡及奥沙利铂耐药的影响

目的探讨干预自噬对结直肠癌细胞铁死亡和奥沙利铂(OXA)耐药的影响及分子机制。方法培养人结直肠癌HCT-8、COLO205、HCT-116、SW620和SW480细胞系,筛选LC3表达适中的HCT-116细胞,检测其与OXA耐药HCT-116/OXA细胞株LC3、p62、Keap1、Nrf2、GPX4蛋白及Fe^(2+)、GSH、MDA的表达差异,并应用自噬和铁死亡干预剂并联合OXA干预HCT-116/OXA细胞株,检测LC3、p62、Keap1、Nrf2、GPX4蛋白及Fe^(2+)、GSH、MDA的表达,CCK-8实验检测各组细胞的增殖活性及对OXA的敏感性,平板克隆、Transwell实验检测各组细胞的生长情况和侵袭能力。结果5组细胞中HCT-116细胞的LC3、p62和GPX4均呈中等表达量;与HCT-116细胞相比,HCT-116/OXA细胞对OXA敏感性较低,且p62、Nrf2、GPX4蛋白呈高表达,LC3和Keap1呈低表达,Fe^(2+)、GSH、MDA表达水平均增高(P<0.05);自噬激活剂Rapa组及Rapa+Fer-1组较Fer-1组和对照组的LC3、Keap1蛋白及Fe^(2+)、MDA水平均升高,而p62、Nrf2、GPX4蛋白及GSH水平呈低表达,且Rapa+Fer-1组GPX4蛋白、GSH的水平低于Rapa组(P<0.05)。在自噬抑制剂组中,CQ组及CQ+Erastin组与对照组和Erastin组相比其LC3、p62、Nrf2、GPX4蛋白及GSH水平均呈高表达,Keap1蛋白、Fe^(2+)、MDA均呈低表达,而Erastin组GPX4蛋白、GSH表达低于其余三组,Fe^(2+)、MDA含量高于其余三组(P<0.05)。自噬激活剂联合应用OXA,Rapa干预组与其余三组相比,其对OXA的化学敏感性高、迁移细胞数量少、细胞增殖活性低;Rapa+Fer-1组对OXA的敏感性低于Rapa组,但高于Fer-1组和对照组(P<0.05)。而Fer-1组与对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。自噬抑制剂联合应用OXA,Erastin、CQ+Erastin和CQ三组与对照组相比其细胞活性、迁移能力和克隆形成能力均降低,其中Erastin组最低,而CQ+Erastin组高于Erastin组、低于CQ组(P<0.05)。结论在结直肠癌中,自噬参与了铁死亡的调节,干预自噬可通过p62-Keap1/Nrf2-GPX4通路调控结直肠癌细胞发生铁死亡,从而逆转OXA耐药。

右美托咪定通过激活Nrf2/HO-1/GPX4通路抑制肾小管上皮细胞的铁死亡

目的 探讨右美托咪定(DEX)对Erastin诱导的人肾小管上皮细胞(HK-2)铁死亡的保护作用及其机制。方法 构建Erastin诱导的HK-2细胞铁死亡模型。将HK-2细胞分为对照组、Erastin模型组、Erastin+2.5μmol/L DEX组、Erastin+5μmol/L DEX组、Erastin+10μmol/L DEX组,采用CCK-8法检测细胞的存活率。将HK-2细胞分为对照组、Erastin模型组、Erastin+10μmol/L DEX组、Erastin+10μmol/L DEX+ML385(Nrf2抑制剂)组。采用CCK-8法检测细胞的存活率;使用细胞亚铁比色法测试盒检测细胞内Fe^(2+)水平的变化;应用流式细胞术检测细胞内活性氧(ROS)的含量;使用丙二醛(MDA)和还原型谷胱甘肽(GSH)试剂盒检测细胞中MDA及GSH含量;Western blotting检测细胞中核因子E2相关因子2(Nrf2)、血红素加氧酶-1(HO-1)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)蛋白的表达。结果 与对照组相比,Erastin组的细胞存活率显著被抑制(P<0.001),同时细胞中GSH含量降低(P<0.001),Fe^(2+)、ROS以及MDA含量升高(P<0.001);与Erastin组相比,Erastin+10μmol/L DEX组的细胞存活率明显升高(P<0.001),10μmol/L DEX显著升高细胞中GSH含量(P<0.001),显著降低Fe^(2+)、ROS以及MDA含量(P<0.001),并且显著上调细胞中Nrf2、HO-1和GPX4蛋白的表达(P<0.001)。使用ML385后,Nrf2/HO-1/GPX4通路被抑制(P<0.001),细胞存活率降低(P<0.001),GSH含量降低(P<0.001),而Fe^(2+)、ROS以及MDA含量升高(P<0.05)。结论 DEX对Erastin诱导的HK-2细胞铁死亡具有保护作用,其机制可能是通过激活Nrf2/HO-1/GPX4通路实现抗氧化应激从而抑制铁死亡。

结直肠癌中Keap1、Nrf2、Gpx4表达与铁死亡的相关性分析及临床意义

目的 探讨结直肠癌中Keap1、Nrf2、Gpx4的表达与铁死亡相关因子PLOOH、MDA、GSH及组织铁含量的相关性及临床意义。方法 收集106例结直肠癌、正常肠黏膜组织,采用免疫组化EnVision法、Western blot、qRT-PCR检测两者中Keap1、Nrf2及Gpx4的表达;应用分光光度法检测PLOOH、组织铁、MDA、GSH的含量,分析其相关性及临床意义。结果 结直肠癌组织中Keap1、Nrf2和Gpx4的阳性率分别为60.5%、35.8%、39.6%,其蛋白相对表达量分别为0.78±0.14、0.70±0.13、0.63±0.10,其mRNA水平分别为0.80±0.018、0.68±0.019、0.52±0.016,各因子在肿瘤中的表达均高于正常肠黏膜组织(P<0.05)。线性回归的对数趋势线分析显示结直肠癌组织中Keap1与Nrf2的表达呈负相关(R2=0.188 1,P<0.05),Nrf2与Gpx4的表达呈正相关(R2=0.252 7,P<0.05)。结直肠癌组织中PLOOH、MDA、GSH及组织铁的平均光密度值分别为0.67±0.07、3.13±0.32、3.32±0.41、102±11.91,其含量均高于正常肠黏膜组织(P<0.05),线性回归的对数趋势线分析显示PLOOH与MDA、组织铁含量呈正相关(P<0.05),而与GSH的表达呈负相关(P<0.05)。PLOOH与Keap1呈正相关(r=0.273,P<0.05),而与Nrf2、Gpx4表达呈负相关(r=-0.304,r=-0.330,P<0.05)。铁死亡、Keap1与结直肠癌患者的预后呈正相关,而Nrf2、Gpx4、浸润深度及淋巴结转移与结直肠癌患者预后呈负相关,是结直肠癌预后的独立危险因素。结论 结直肠癌中存在铁死亡现象,其与Keap1/Nrf2-Gpx4的表达有关,并且与患者预后密切相关。

松油烯-4-醇调节SIRT1/Nrf2信号抑制慢性肾病血管氧化应激损伤

目的探讨松油烯-4-醇(T4O)对慢性肾脏疾病(CKD)模型小鼠血管氧化应激损伤的作用及信号机制。方法采用高磷饲料联合腺嘌呤制备CKD小鼠模型,正常对照组给予等体积生理盐水灌胃。通过尾静脉注射慢病毒SIRT1 RNAi,建立SIRT1体内低表达的CKD小鼠模型用于信号机制研究。给药组以T4O低、高剂量(10 mg/kg和20 mg/kg)连续灌胃给药6周。收集小鼠血清检测尿素氮(BUN)和肌酐(CRE)水平,采用HE染色观察小鼠胸主动脉和肾脏组织形态,试剂盒检测血管组织丙二醛(MDA)及超氧化物歧化酶(SOD)含量,免疫荧光检测血管组织ROS水平;Western blot法检测Nrf2、HO-1、NQO-1及SIRT1的表达。结果T4O可降低CKD小鼠血清BUN和CRE水平,改善肾脏病理损伤和主动脉血管形态结构,降低血管组织MDA含量,增加SOD含量,降低ROS水平;T4O干预能够促进Nrf2核易位及上调HO-1、NQO-1以及SIRT1的蛋白表达。分子机制研究表明,LV-SIRT1 RNAi+T4O+CKD组能够抑制T4O对CKD诱导的MDA和SOD含量的影响,部分抵消T4O上调Nrf2核易位以及SIRT1、HO-1、NQO-1的蛋白表达水平的作用。结论T4O对CKD小鼠胸主动脉氧化应激损伤具有保护作用,其分子信号机制可能与调节SIRT1/Nrf2级联信号有关。

4⁃辛基衣康酸通过Keap1/Nrf2/GPX4通路减少癫痫大鼠海马神经元铁死亡

目的:探讨4⁃辛基衣康酸(4⁃OI)对癫痫大鼠海马神经元铁死亡的影响。方法:雄性SD大鼠45只,随机分为生理盐水组、戊四氮组(PTZ)和4⁃辛基衣康酸和戊四氮联合治疗组(4⁃OI+PTZ)。观察记录各组大鼠癫痫发作程度行为学及脑电图变化,应用尼氏染色观察海马区神经元变化,膜片钳技术评估海马CA1区的神经元兴奋性,试剂盒测定海马区铁离子、谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)水平,采用免疫组化与Western Blot检测各组大鼠海马区神经元核因子红细胞2相关因子2(Nrf2)、Klech样ECH关联蛋白1(Keap1)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、前列腺素内过氧化物合成酶2(PTGS2)的表达情况。结果:与生理盐水组比较,PTZ组癫痫样发作明显,神经元尼氏体的含量显著减少,神经元的兴奋性显著增加,海马区铁离子、MDA、PTGS2与Keap1的表达明显升高,GSH、Nrf2、GPX4的表达明显下降(P<0.05);与癫痫组相比,4⁃OI处理组癫痫发作等级降低,神经元尼氏体的含量显著增加,神经元的兴奋性显著下降,海马区铁离子、MDA、PTGS2与Keap1的表达明显下降,GSH、Nrf2与GPX4的表达明显升高(P<0.05)。结论:4⁃OI可以通过抑制癫痫模型大鼠海马组织中Keap1的活性,进而上调Nrf2和GPX4表达,抑制神经元铁死亡并缓解癫痫发作。

人参皂苷Rg1通过激活Nrf2/xCT/GPX4通路抑制神经元铁死亡改善缺血性脑卒中损伤

目的研究人参皂苷Rg1对缺血性脑卒中后神经元铁死亡的抑制作用及其机制。方法细胞水平建立HT22细胞氧糖剥夺/复氧(oxygen glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)模型,CCK-8法检测Rg1对OGD/R损伤后HT22细胞活力的影响,试剂盒检测细胞铁死亡标志物GSH/GSSG、SOD、MDA和Fe 2+含量的影响;Western blot检测细胞GPX4、xCT和Nrf2蛋白的变化;ML385干预Nrf2验证其在Rg1调节OGD/R引起的细胞铁死亡中的作用。动物水平建立大鼠短暂性大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)再灌注模型,分为假手术组、模型组、Rg1治疗组(40 mg·kg^(-1))和Fer-1铁死亡抑制剂组(0.2 mg·kg^(-1))。缺血90 min后拔栓并给药,再灌注24 h后进行Zea Longa和Garcia Test评分评估神经受损程度;透射电镜观察皮质神经元线粒体形态变化;Western blot检测GPX4和xCT蛋白水平。结果Rg1能明显提高OGD/R后HT22细胞存活率,上调GSH/GSSG比值,恢复SOD活性,降低MDA和Fe 2+含量,并促进GPX4,xCT和Nrf2蛋白表达,而ML385干预明显抑制了Rg1对OGD/R后HT22细胞存活率及GPX4、xCT蛋白的上调作用。在体动物实验结果表明,Rg1可上调MCAO大鼠皮质组织GPX4和xCT的表达,缓解神经元线粒体的形态损伤,改善神经功能。结论人参皂苷Rg1可通过促进Nrf2/xCT/GPX4通路抑制缺血性脑卒中神经元铁死亡。

nRF24LU1+的USB无线网络系统设计

提出一种把有线的USB传输转化为USB无线传输的网络系统设计;介绍了该USB无线网络系统的工作原理,给出无线收发主机和无线收发从机的具体硬件电路原理图;重点阐述了nRF24LU1+的USB模块固件程序和无线模块程序的设计。

西红花酸调控Nrf2/HO-1通路抑制高糖诱导人肾小球系膜细胞铁死亡

目的 探讨西红花酸抑制高糖诱导人肾小球系膜细胞(HGMCs)铁死亡的作用机制。方法 (1)体外培养HGMCs,将细胞分为空白对照组、阴性对照组(60 mmol·L^(-1)甘露醇)和葡萄糖实验组(30、60、90 mmol·L^(-1)),干预培养48 h后,采用CCK-8法检测细胞存活率,采用RT-qPCR法检测谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)mRNA表达,以确定高糖诱导HGMCs的造模条件。(2)体外培养HGMCs,分为空白对照组和西红花酸给药组(5、25、125μmol·L^(-1)),干预培养24 h后,采用CCK-8法检测细胞存活率。(3)体外培养HGMCs,将细胞分为空白对照组、模型组(60 mmol·L^(-1)葡萄糖)、西红花酸组(60 mmol·L^(-1)葡萄糖+5、25、125μmol·L^(-1)西红花酸)及阳性对照组[60 mmol·L^(-1)葡萄糖+1μmol·L^(-1)铁死亡抑制剂(Ferrostatin-1,Fer-1)]。干预培养48 h后,采用CCK-8法检测细胞存活率;流式细胞术检测细胞内活性氧(ROS)水平;Western Blot法检测细胞GPX4、血红素加氧酶-1(HO-1)、转铁蛋白受体(TFRC)蛋白表达;采用免疫荧光法与Western Blot法检测HGMCs细胞核中核因子E2相关因子2(Nrf2)蛋白表达。结果 (1)与空白对照组比较,阴性对照组的细胞存活率及GPX4mRNA表达水平无明显差异(P>0.05);30、60、90 mmol·L^(-1)葡萄糖实验组的细胞存活率及GPX4 mRNA表达水平均显著降低(P<0.01),且以60 mmol·L^(-1)浓度组作用最为明显。(2)与空白对照组比较,5μmol·L^(-1)西红花酸组的HGMCs细胞存活率无明显影响(P>0.05),25、125μmol·L^(-1)西红花酸组的HGMCs细胞存活率显著升高(P<0.01),该浓度西红花酸对HGMCs无明显细胞毒性。(3)与空白对照组比较,模型组的HGMCs细胞存活率显著降低(P<0.01);细胞内ROS水平显著上升(P<0.01);GPX4蛋白表达水平明显下降(P<0.05);细胞核内Nrf2蛋白表达显著下调(P<0.001)。与模型组比较,25、125μmol·L^(-1)西红花酸组的HGMCs细胞存活率明显升高(P<0.05);细胞内ROS水平均显著下降(P<0.01),并呈浓度依赖性;西红花酸125μmol·L^(-1)组HGMCs细胞GPX4、HO-1蛋白表达水平明显上调(P<0.05,P<0.01),与阳性对照药物Fer-1效果相近(P>0.05);西红花酸125μmol·L^(-1)组HGMCs细胞核内Nrf2蛋白表达显著上调(P<0.001)。各组间的HGMCs细胞TFRC蛋白表达无明显差异(P>0.05)。结论 西红花酸能够抑制高糖诱导HGMCs细胞铁死亡,减少细胞内ROS生成,上调GPX4蛋白表达,可能与上调Nrf2/HO-1通路密切相关。

Exendin-4通过激活Nrf2/HO-1通路减轻糖尿病小鼠的肝脏氧化应激及纤维化

目的探讨Exendin-4对链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病小鼠肝脏脂质代谢、氧化应激以及纤维化的作用以及其潜在的机制。方法将C57BL/6J小鼠随机分为对照组和糖尿病组(DM)。糖尿病组小鼠给予高脂饮食4周联合STZ造模,对照组小鼠普通饮食。DM小鼠造模成功后,再随机分为糖尿病对照组(DM-con)和糖尿病干预组(DM+E4)。DM+E4组小鼠给予Exendin-4每天1 nmol/kg体重,腹腔注射1次,共8周。监测体重、随机血糖,分析各组小鼠血脂水平,RT-PCR检测肝脏脂质代谢、纤维化和氧化应激指标,HE、天狼猩红以及油红O染色观察肝脏结构变化,Western blot检测肝脏TGF-β1、Nrf2以及HO-1的表达。结果DM组小鼠的血糖和体重较对照组明显升高(P<0.001),肝脏脂质沉积、纤维化以及氧化应激较对照组也显著增加,给予Exendin-4干预未显著改善肝脏的脂质沉积,但是Exendin-4治疗后糖尿病组小鼠血糖及TG明显降低(P<0.05),肝脏纤维化指标TGF-β、α-SMA及Col-I显著降低(P<0.05),抗氧化指标Nrf2、HO-1及GPX4显著升高(P<0.01)同时Nrf2和HO-1的蛋白表达水平也显著升高(P<0.01)。结论 Exendin-4在肝脏脂质沉积未明显减轻的情况下通过激活Nrf2/HO-1信号通路显著改善糖尿病小鼠的肝脏纤维化及氧化应激。

DPP-4抑制剂通过Nrf2/HO-1/P21信号通路抑制肺动脉平滑肌细胞增殖的分子机制研究

目的明确DPP-4抑制剂西格列汀对肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)增殖的影响,并探讨相关的分子机制。方法体外培养大鼠PASMCs并随机分为对照组、5-HT组、不同浓度(2.5,5,10,20,40μmol/L)西格列汀预处理+5-HT组,应用BrdU试剂盒检测各组细胞增殖情况并筛选西格列汀作用浓度;用西格列汀刺激PASMCs 24 h,应用Western blot检测细胞中Nrf2及HO-1的蛋白水平。为进一步研究信号通路机制,PASMCs分为对照组、5-HT组、西格列汀+5-HT组、Nrf2抑制剂ML385+西格列汀+5-HT组、HO-1抑制剂SnPP+西格列汀+5-HT组、P21 siRNA预转染+西格列汀+5-HT组,采用BrdU掺入法检测各组细胞增殖情况,应用Western blot检测各组细胞中P21的蛋白水平。结果20 mol/L西格列汀+5-HT组PASMCs增殖率明显低于5-HT组(P<0.05),且20μmol/L西格列汀作用24 h,Nrf2及HO-1的蛋白表达均高于对照组(P<0.05)。进一步机制研究发现,与5-HT组相比,西格列汀+5-HT组的P21表达水平升高(P<0.05),而预先给予Nrf2或HO-1抑制剂联合西格列汀,P21水平的上调被逆转(P<0.05)。而且预先联合Nrf2或HO-1抑制剂或预转染P21 siRNA,西格列汀对PASMCs增殖的抑制作用也被逆转(P<0.05)。结论DPP-4抑制剂西格列汀可通过激活Nrf2/HO-1/P21信号通路,进而抑制PASMCs增殖。

小檗碱通过激活Nrf2-HO-1/GPX4通路抑制小鼠海马神经元HT22细胞的铁死亡

目的探讨小檗碱对于Erastin诱导小鼠海马神经元HT22细胞的铁死亡的保护作用及其可能机制。方法以HT22小鼠海马神经元细胞为研究对象,分为对照组、Erastin模型组、Erastin+30μmol/L BBR组、Erastin+60μmol/L BBR组。采用CCK-8法、特异性Fe2+荧光探针、荧光染料(DAPI)检测和荧光探针(H2DCFH-DA)检测各实验组细胞的增殖情况、活性铁水平、细胞凋亡和活性氧(ROS)变化。RT-qPCR和Western blot分别检测各实验组细胞的Nrf2、HO-1、GPX4 mRNA和蛋白表达情况。以60μmol BBR的最适浓度来进一步探究其作用机制,分为对照组、Erastin模型组、Erastin+60μmol/L BBR组、Erastin+60μmol/L BBR+2μmol Nrf2抑制剂ML385组。通过使用荧光探针和Western blot检测Nrf2抑制剂(ML385)作用后的活性铁的水平、活性氧含量以及Nrf2、HO-1、GPX4蛋白的表达来验证小檗碱调节的Nrf2-HO-1/GPX4通路对Erastin处理的HT22细胞的保护作用。结果0.5μmol/L Erastin作用于HT22细胞8 h,细胞存活率与对照组相比显著被抑制(P<0.05);同时细胞凋亡、ROS以及活性铁含量增加(P<0.05)。与Erastin组比较,Erastin+30μmol/L BBR组和Erastin+60μmol/L BBR组的细胞存活率明显升高(P<0.05),同时显著降低细胞凋亡、ROS以及活性铁含量(P<0.05)。小檗碱增加HT22细胞中Nrf2、HO-1、GPX4基因及蛋白的表达量(P<0.05)。加入Nrf2抑制剂ML385后,Nrf2-HO-1/GPX4通路被抑制,并且ROS以及活性铁含量升高(P<0.05)。结论Erastin诱导HT22细胞发生铁死亡,小檗碱抑制Erastin诱导的铁死亡,可能机制是激活了Nrf2-HO-1/GPX4通路。

Erianin inhibits oral cancer cell growth,migration,and invasion via the Nrf2/HO-1/GPX4 pathway

Objective:To evaluate the effect of erianin on the viability,migration,and invasion of KB cells and elucidate its underlying mechanisms.Methods:Cell Counting Kit-8,colony formation,wound healing,and Transwell assays were used to determine the proliferation,migration,and invasion of oral cancer KB cells.Furthermore,malondialdehyde(MDA)and glutathione(GSH)levels were determined.Fluorescent probes were used to detect changes in intracellular reactive oxygen species and iron ions.Additionally,the expressions of ferroptosis-related proteins,NF-E2-related factor 2(Nrf2),ferritin heavy chain 1(FTH1),heme oxygenase 1(HO-1),and glutathione peroxidase 4(GPX4)were analyzed by Western blotting assays.Results:Erianin induced ferroptosis and inhibited the proliferation,migration,and invasion of KB cells.Moreover,erianin decreased GSH level,increased MDA level,elevated intracellular ROS and Fe2+contents,and downregulated the expression of the ferroptosis-related proteins Nrf2,HO-1,GPX4,and FTH1 in KB cells.These effects of erianin were effectively reversed by a ferroptosis inhibitor,ferrostatin-1.Conclusions:Erianin inhibits the proliferation,migration,and invasion of oral cancer cells and induces ferroptosis via the Nrf2/HO-1/GPX4 signaling pathway.Therefore,erianin may be a potential candidate for the treatment of oral cancer.

黄芪甲苷控Nrf2/HO-1/GPX4通路抑制铁死亡改善ApoE^(-/-)小鼠动脉粥样硬化的机制研究

基于核因子红细胞系2相关因子2(nuclear factor erythroid-2-related factor 2,Nrf2)/血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)/谷胱甘肽过氧化酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)信号通路观察黄芪甲苷(astragalosideⅣ,AS-Ⅳ)对ApoE^(-/-)小鼠动脉粥样硬化的干预作用,探究AS-Ⅳ改善动脉粥样硬化小鼠铁死亡的潜在机制。该研究通过采用高脂饲料喂养建立动脉粥样硬化小鼠模型。造模8周后将ApoE^(-/-)小鼠随机分为模型(model)组、AS-Ⅳ组、AS-Ⅳ+Nrf2抑制剂(ML385)组和ferrostatin-1(Fer-1)组,同时另设对照(control)组,分别给予相应药物腹腔注射治疗,control组与model组进行等量生理盐水腹腔注射。实验结束后采用全自动血脂分析仪检测血清生化水平,HE染色观察主动脉窦组织形态学变化,比色法检测各组小鼠血清中Fe^(2+)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)水平,免疫荧光观察各组小鼠主动脉窦铁蛋白重链1(ferritin heavy chain 1,FTH1)、铁蛋白轻链(ferritin light chain,FTL)蛋白表达,Western blot法检测小鼠主动脉脏组织Nrf2、HO-1、GPX4蛋白水平,透射电镜观察主动脉组织超微结构改变。结果显示,与control组比较,model组小鼠主动脉窦钙化面积及斑块沉积面积明显,线粒体膜密度增加、线粒体嵴减少或消失,血清总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、Fe^(2+)、MDA水平升高,高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、SOD、GSH水平下降,主动脉Nrf2、HO-1、GPX4蛋白及铁储存蛋白FTH1、FTL表达明显抑制;与model组相比,AS-Ⅳ治疗后血清TC、TG、LDL-C、Fe^(2+)、MDA水平下降,HDL-C、SOD、GSH水平上升,主动脉Nrf2、HO-1、GPX4蛋白及铁储存蛋白FTH1、FTL蛋白表达增加,主动脉组织形态学明显改善;与AS-Ⅳ组相比,Nrf2抑制剂ML385能逆转AS-Ⅳ对AS小鼠的治疗作用。以上表明,AS-Ⅳ可抑制铁死亡改善ApoE^(-/-)小鼠动脉粥样硬化,其作用机制可能与调控Nrf2/HO-1/GPX4信号通路有关。

川芎嗪激活Nrf2/HO-1/CXCR4通路调控神经干细胞迁移干预缺血再灌注大鼠的作用机制

以核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)/血红素加氧酶1(heme oxygenase 1,HO-1)/趋化因子C-X-C-基元受体4(C-X-C motif chemokine receptor 4,CXCR4)通路为切入点,探讨川芎嗪(tetramethylpyrazine,TMP)干预大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型大鼠脑内神经干细胞(neural stem cells,NSCs)迁移的作用机制。SD大鼠分为假手术组、模型组、TMP 20 mg·kg^(-1)组和TMP 40 mg·kg^(-1)组;通过神经功能缺失评分评价神经功能损伤;免疫荧光法检测脑组织5-溴脱氧尿苷(5-bromodeoxyuridine,BrdU)/双皮质素(doublecortin,DCX)双标细胞;观察TMP对C17.2细胞迁移的影响;蛋白免疫印迹法检测脑组织和C17.2细胞中Nrf2、HO-1、p62、醌氧化还原酶1[NAD(P)H quinone oxidoreductase 1,NQO1]、基质细胞衍生因子1(stromal cell-derived factor 1,SDF-1)、CXCR4蛋白表达。结果显示,大鼠脑缺血7、21 d后,神经功能损伤评分及BrdU+/DCX+细胞显著升高,脑组织中Nrf2及CXCR4表达均显著升高;与模型组相比,TMP 40 mg·kg-1可显著降低神经功能评分,进一步升高BrdU+/DCX+细胞数量及Nrf2、CXCR4及SDF-1表达;此外TMP可以显著促进C17.2细胞迁移,且时间以及剂量依赖性提高p62、Nrf2、HO-1、NQO1表达,TMP 50μg·mL^(-1)给药12 h表达量最高(P<0.01)。综上,TMP可通过活化Nrf2/HO-1/CXCR4通路,促进NSCs迁移从而发挥抗缺血再灌注损伤作用。该研究为TMP在缺血性脑卒中疾病中的应用提供了实验支持。

基于Nrf2/HO-1/GPX4信号通路探讨真武汤改善脾肾阳虚型糖尿病肾病小鼠的作用机制

目的:基于核因子E2相关因子2(Nrf2)/血红素氧合酶-1(HO-1)/谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)信号通路探讨真武汤对脾肾阳虚型糖尿病肾病(DKD)小鼠肾脏氧化损伤的干预作用及机制。方法:将25只7周龄SPF级雄性db/m小鼠及95只7周龄SPF级雄性db/db小鼠适应性喂养1周。db/m小鼠作为空白组,其余小鼠进行运用灌服生大黄溶液和氢化可的松制备脾肾阳虚型DKD模型,成模后随机分为模型组、厄贝沙坦组(25 mg·kg^(-1))、真武汤高、中、低剂量(33.8、16.9、8.45 g·kg^(-1))组,每组15只,连续灌胃8周。观察小鼠生存状态和计算中医证候评分并测定脾肾阳虚相关、空腹血糖(FBG)及肾功能相关指标;苏木素-伊红(HE)染色观察各组肾脏组织病理学改变;生化试剂盒法测定肾组织中氧化应激相关指标;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测各组小鼠肾组织中Nrf2、HO-1、谷氨酸半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC)、GPX4 m RNA和蛋白表达水平。结果:与空白组比较,模型组小鼠中医证候积分明显升高(P<0.05),雌二醇(E2)含量明显升高(P<0.05),睾酮(T)、三碘甲状腺原氨酸(T3)、四碘甲状腺原氨酸(T4)含量明显降低(P<0.05);FBG明显升高(P<0.05),肾功能明显下降(P<0.05);肾脏病理显示肾小球肥大,肾小球系膜和基底增厚明显,肾组织中过氧化氢酶(CAT)、总抗氧化能力(T-AOC)、还原型谷胱甘肽(GSH)水平均明显降低(P<0.05),丙二醛(MDA)的含量明显升高(P<0.05),肾组织中Nrf2、HO-1、GCLC、GPX4 m RNA及蛋白表达水平明显下降(P<0.05);与模型组比较,真武汤高、中剂量组中医证候积分明显降低、E2含量明显降低(P<0.05),T、T3、T4含量明显升高(P<0.05);肾功能明显改善(P<0.05),肾脏病理明显改善,真武汤高、中剂量组小鼠肾组织中CAT、T-AOC、GSH水平均明显升高(P<0.05),MDA的含量明显下降(P<0.05),各给药组小鼠肾组织中Nrf2、HO-1、GCLC、GPX4 m RNA及蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。结论:真武汤改善脾肾阳虚型db/db小鼠一般状态、肾功能,降低氧化损伤和减轻肾脏病理改变,其作用机制可能与调节Nrf2/HO-1/GPX4通路有关。

芦丁在BV2细胞中抗弓形虫的作用及机制分析

本研究旨在分析芦丁在BV2细胞中的体外抗弓形虫作用及其潜在机制。首先通过CCK8法、间接荧光染色法等测定芦丁的细胞毒性、弓形虫抑制率及增殖情况以探究芦丁在BV2细胞中的抗弓形虫作用;随后,将细胞分成4组,分别为:空白组(Normal)、感染对照组(T.gondii)、感染后低剂量芦丁治疗组(Rut 50)和感染后高剂量芦丁治疗组(Rut 100),进行弓形虫感染及芦丁处理试验,并用ELISA等方法检测细胞培养液上清液中抗氧化酶SOD、GSH及脂质氧化产物MDA水平,炎症因子TNF-α、IL-6及IL-1β水平,用Western blot检测BV2细胞中PI3K/AKT/Nrf2/HO-1、TLR4/NF-κB及P2X7R/NLRP3信号通路中关键蛋白表达量。结果表明,在BV2细胞中,50和100μg·mL^(-1)的芦丁具有明显的抗虫效果,可显著抑制弓形虫感染率、入侵能力和增殖(P<0.05)。50和100μg·mL^(-1)的芦丁还可显著增多上清液中的SOD、GSH含量并降低MDA含量(P<0.05),且降低TNF-α、IL-6及IL-1β水平(P<0.05),并显著上调抗氧化通路PI3K/AKT/Nrf2/HO-1、下调炎症通路TLR4/NF-κB及P2X7R/NLRP3中关键蛋白表达量(P<0.05)。结果提示,芦丁在BV2细胞中具有明显的抗弓形虫作用,这可能与其可以通过激活PI3K/AKT/Nrf2/HO-1通路从而增强细胞抗氧化能力、以及抑制TLR4/NF-κB及P2X7R/NLRP3通路从而减弱炎症反应有关。研究结果可为后续探究芦丁体内抗虫效果及分析其对弓形虫性脑损伤保护机制相关研究提供一定的理论参考,并为将芦丁开发成治疗人畜弓形虫病的潜在药物提供科学依据。

NR4A1通过上调NRF2表达抑制顺铂诱导的近端肾小管上皮细胞铁死亡

目的探究核受体亚家族4 A组成员1(nuclear receptor subfamily 4 group A member 1,NR4A1)在缓解顺铂对近端肾小管上皮细胞毒性的作用及其分子机制。方法通过"Tabula-muris"单细胞转录组测序数据库分析肾脏组织各细胞亚群NR4A1基因的表达。在近端肾小管上皮细胞HK-2细胞系及原代细胞中,通过慢病毒感染以过表达NR4A1基因。采用细胞增殖与毒性检测试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)检测顺铂的细胞毒性。细胞用碘化丙啶(propidium iodide,PI)单染后通过流式细胞仪检测细胞的死亡比例。通过实时荧光定量PCR和Western印迹法检测细胞中NR4A1和核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,NRF2)基因的表达。通过检测丙二醛(malondialdehyde,MDA)和氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione,GSSG)以及脂质活性氧(reactive oxygen species,ROS)的含量分析细胞铁死亡程度。结果单细胞转录组数据分析的结果表明NR4A1基因表达在肾脏组织的近端肾小管上皮细胞亚群中最低。50μmol/L和100μmol/L顺铂能够显著诱导近端肾小管上皮细胞MDA、GSSG和脂质ROS含量的上升(均P<0.01),且顺铂浓度越高诱导MDA、GSSG和脂质ROS增加越多。相比对照HK-2细胞,过表达NR4A1的HK-2细胞脂质ROS含量及铁离子含量显著较低(均P<0.01),过表达NR4A1抑制了顺铂对近端肾小管上皮细胞的毒性及其诱导的铁死亡。分子机制研究发现,在近端肾小管上皮细胞中,过表达NR4A1上调了抗铁死亡基因NRF2的表达(P<0.01)。进一步单细胞转录组数据分析的结果表明,与NR4A1在肾脏组织细胞亚群的表达状态相似,NRF2表达在近端肾小管上皮细胞中也最低。结论顺铂能够诱导近端肾小管上皮细胞发生铁死亡,且浓度越高越明显。NR4A1通过上调近端肾小管上皮细胞NRF2的表达抑制顺铂诱导的细胞铁死亡,从而缓解顺铂对细胞的毒性。