气肿疽梭菌NanA基因核酸疫苗的免疫效果评价

为了检测气肿疽梭菌NanA基因核酸疫苗的免疫效果,在成功构建pVAX1-NanA真核表达重组质粒的基础上将其转染至Vero细胞,通过间接免疫荧光鉴定其表达,并将成功构建的pVAX1-NanA质粒大量提取后免疫Balb/c小鼠,设置pVAX1-NanA核酸疫苗组、pVAX1空载体组和PBS对照组。对小鼠采血并分离血清,用ELISA测定血清中的IgG、IgG1、IgG2a抗体水平和IFN-γ、IL-4细胞因子水平;第3次免疫2周后,用流式细胞仪测定小鼠脾脏中的CD4^+和CD8^+T细胞水平。结果表明,pVAX1-NanA核酸疫苗免疫Balb/c小鼠后,小鼠血清中IgG、IgG1、IgG2a的抗体水平极显著高于pVAX1空载体组和PBS对照组(P<0.01);IFN-γ和IL-4细胞因子水平极显著高于pVAX1空载体组和PBS对照组(P<0.01);CD4^+、CD8^+T细胞分析表明,pVAX1-NanA免疫组的CD4^+和CD8^+T细胞水平显著高于pVAX1组和PBS对照组(P<0.05),pVAX1-NanA核酸疫苗组的CD4^+/CD8^+T细胞比值高于pVAX1空载体组与PBS对照组(P<0.05),pVAX1空载体组和PBS对照组之间无显著差异(P>0.05)。试验成功制备了pVAX1-NanA核酸疫苗,且pVAX1-NanA核酸疫苗可刺激Balb/c小鼠产生体液免疫和细胞免疫。

气肿疽NanA基因真核表达质粒的构建与鉴定

为构建气肿疽NanA基因真核表达质粒,根据GenBank中已发表的气肿疽梭菌NanA基因序列,设计合成了1对特异性引物,以气肿疽梭菌基因组DNA为模板,扩增出NanA目的基因并克隆至pMD 18-T simple载体,将连接后的pMD 18-T-NanA进行鉴定分析。将克隆质粒pMD 18-T-NanA进行双酶切后,与pVAX1真核表达质粒连接。结果表明:构建的重组克隆质粒pMD 18-T-NanA和重组表达质粒pVAX1-NanA经PCR鉴定和酶切鉴定正确。该试验成功构建了气肿疽NanA基因真核表达质粒,为气肿疽核酸疫苗的制备奠定了基础。

气肿疽梭菌NanA基因克隆及生物信息学分析

为了对气肿疽梭菌NanA基因进行克隆及生物信息学分析,试验根据GenBank中已发表的气肿疽梭菌NanA基因序列设计并合成1对特异性引物,以气肿疽梭菌总DNA为模板,扩增出NanA目的基因并克隆至pMD18-T载体中,对测序正确的NanA基因进行序列对比分析,对NanA蛋白进行理化性质分析与二级结构预测,同时使用在线软件预测NanA蛋白三级结构。结果表明:成功扩增出气肿疽梭菌Nan A基因,与参考序列相比,共存在3处核苷酸突变,核苷酸序列和氨基酸序列与NCBI公布的JF4135 NanA基因序列的同源性均为99.8%。NanA蛋白分子质量约为71 ku,具有较高的抗原指数,二级结构以β-折叠和无规则卷曲为主,有多个抗原表位区域。

气肿疽梭菌不同靶基因检测方法的比较

为检测牛、羊等反刍动物的气肿疽梭菌,筛选出更为特异、敏感的PCR检测方法,分别以fli A(C)、nan A、cct A为靶基因进行PCR检测,并对其敏感性、特异性等方面进行比较。结果表明,以cct A为靶基因的PCR检测方法敏感性最高,最小检测DNA量为12.30×10^(-5)pg/μL;以fli A(C)、nan A为靶基因的PCR检测方法敏感性较低,最小检测DNA量为0.123 ng/μL;3种靶基因引物菌未扩增出D型产气荚膜梭菌、E型产气荚膜梭菌、腐败梭菌、巴氏杆菌等基因片段,具有较好的特异性。本试验为气肿疽的快速诊断提供了更为敏感、特异的检测技术。