nanoLC-MS/MS检测未成熟树突状细胞与其外泌体蛋白组分差异的初步研究

目的采用一种相对快速、样品需求量少的纳升级液相色谱串联质谱(nanoLC-MS/MS)法初步探究未成熟树突状细胞DC2.4及其来源的外泌体(DC-Exo)蛋白组分差异。方法收集DC2.4细胞培养基上清,采用梯度离心法分离DC-Exo,使用蔗糖密度梯度超速离心进一步纯化而获得DC-Exo测定样品。采用Bradford法测定其蛋白总量,使用动态光散射法和透射电镜分别对DC-Exo粒度分布和形态进行考察。采用FASP酶解法制备DC2.4细胞和DC-Exo待测蛋白样品。nanoLC-MS/MS检测待测样品:采用μLPickUp上样模式,上样量仅1μg,Transport liquid及Micro A相均为0.05%三氟乙酸-2%乙腈(V/V)aq.;nanoLC使用Acclaim?PepMap RSLC分析柱,流动相为(A)0.1%甲酸水溶液(V/V)和(B)0.08%甲酸-80%乙腈(V/V),采用梯度洗脱,流速为0.3μL/min;MS/MS采用LTQ Obitrap双重质谱,使用APCI nanospray离子源,"一拖十"数据采集模式。得到结果以Uniport Mouse (Fasta文件)为蛋白数据库,采用SQUEST对DC2.4细胞及DC-Exo蛋白质谱信息进行搜索和匹配,并整理分析。结果得到产量较高、粒径为40~200 nm的DC-Exo。用FASP酶解法处理得到的DC2.4细胞和DC-Exo冻干蛋白样品复溶后可直接上样,且上样量仅需1μg。搜库结果显示,DC2.4细胞含蛋白998种,其中高表达227种,特有蛋白535种;DC-Exo仅含蛋白348种,其中特有高表达18种;两者共有蛋白为306种,共有高表达蛋白7种。结论本实验采用的nanoLC-MS/MS法所需进样量少,可相对快速地初步检测DC2.4细胞及其外泌体的蛋白组分差异。

CESI-MS/MS和NanoLC-MS/MS技术对促红细胞生成素中糖肽的分析

目的:使用无鞘液毛细管电泳-质谱联用(CESI-MS/MS)和纳升液相色谱-质谱联用(NanoLCMS/MS)2种方法,对高糖基化蛋白促红细胞生成素(EPO)的糖肽进行分析,并对2种方法的分析结果进行对比。方法:以EPO为研究对象,还原烷基化后用胰蛋白酶进行酶切,酶切得到的肽段利用CESIMS/MS和NanoLC-MS/MS检测方法进行分离鉴定。CESI-MS/MS分析方法:采用熔融的石英毛细管,以10%醋酸水溶液为背景电解质,在34.5 kPa压力下进样60 s,分离电压为30 kV,同时施加正向压力6.9kPa;离子源温度为50℃,喷雾电压为1650 V,MS扫描范围为m/z 350~1250,MS/MS扫描范围为m/z 100~1500。NanoLC-MS/MS分析方法:采用YMC C_(18)色谱柱,以含0.1%甲酸的水溶液(A)-含0.1%甲酸的乙腈溶液(B)为流动相,梯度洗脱,流速5μL·min^(-1);离子源温度300℃,喷雾电压为+5500 V,MS扫描范围为m/z 350~1250,MS/MS扫描范围为m/z 100~1500。将采集到的质谱数据导入到软件BiopharmaView^(TM)3.0中进行搜库检索,对糖肽进行鉴定。结果:采用CESI-MS/MS方法可以单独鉴定到32条糖肽,采用NanoLC-MS/MS方法可以单独鉴定到40条糖肽;通过2种方法可以共鉴定到84条糖肽,共涉及56种糖型。对比2种方法的结果,发现对于EPO糖肽的分析,CESI-MS/MS方法可以鉴定到更多的含唾液酸的糖肽,并表现了更优异的分离效果。此外,CESI-MS/MS方法鉴定出的糖肽分子量范围更宽,可以有效分析NanoLC-MS/MS方法中未鉴定到的高分子量糖肽。结论:在糖蛋白的分析中,通过糖肽水平的分离和鉴定,可以获得糖基位点和糖基序列的信息。CESI-MS/MS方法和NanoLC-MS/MS方法提供了互补的分析结果,其联合使用可鉴定出更多种类的糖肽,为糖蛋白的研究中糖肽水平的分析提供了更全面的解决方案。

3种链霉菌纳米区室蛋白encapsulin在白色链霉菌J1074中的表达

目的探寻3种链霉菌纳米区室蛋白(encapsulin)基因是否在链霉菌模式菌中成功表达。方法将3种encapsulin基因重组于白色链霉菌Streptomyces albus J1074基因组中,利用亲和层析、超滤、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、纳米液相色谱串联质谱(NanoLC-MS/MS)等技术鉴定其表达情况。结果SDS-PAGE结果显示,与野生型菌株相比,构建的重组菌均能表达相对分子质量(Mr)约30×103的差异蛋白,经NanoLC-MS/MS分析,所表达的差异蛋白与3种encapsulin均具有较高的相似度。结论3种encapsulin基因成功在S.albus J1074中实现异源表达,为链霉菌纳米区室蛋白用于高效合成抗生素奠定基础。

应用于原代T细胞酪氨酸磷酸化蛋白质组的高灵敏度分析方法

酪氨酸磷酸化在T细胞的信号转导过程中发挥着重要的作用,然而其丰度较低,鉴定困难。生物组织样本中分离获得的原代T细胞数量较少,培养和扩增的难度较大,因而常使用永生化细胞系来研究T细胞的酪氨酸磷酸化介导的信号转导过程,这通常会导致获得与原代T细胞相差较大的结论。因此,本研究发展了一种解析原代T细胞酪氨酸磷酸化修饰信号的高灵敏度的蛋白质组学方法。首先,针对原代T细胞数量有限的问题,本研究优化了一套从小鼠脾脏中分离、活化和扩增T细胞的完整流程,第4天时T细胞数量扩增到7倍以上;其次,针对酪氨酸磷酸化修饰丰度较低、不易被质谱检测的难题,本研究利用SH2超亲体(SH2-superbinder)亲和富集和固定化钛离子亲和色谱(Ti^(4+)-IMAC)技术对抗CD3和抗CD28单克隆抗体共刺激条件下的原代T细胞多肽样品进行了酪氨酸磷酸化多肽富集,并结合纳升液相色谱-串联质谱(nanoLC-MS/MS)进行解析。最终成功从1 mg蛋白质中鉴定到282个酪氨酸磷酸化位点,其中包含T细胞受体膜蛋白CD3胞内区的免疫受体酪氨酸激活序列(ITAM)上的多个酪氨酸磷酸化位点,以及信号转导相关蛋白ZAP70、LAT、VAV1等的重要位点信息。综上,本研究发展了一套深度解析原代T细胞中的酪氨酸磷酸化修饰的高灵敏度蛋白质组学分析流程,有望应用于绘制更接近生理状态下的信号转导网络。

应用nanoLC／MS／MS对人羊水的蛋白质组学分析

建立应用nano LC/MS/MS技术寻找羊水特异性表达蛋白质的蛋白质组学方法.羊膜穿刺获取两份正常妊娠晚期的羊水,通过Cibacron blue和Protein A吸附去除血清白蛋白和IgGs,样品经变性、还原和烷基化后酶解,nano LC/MS/MS分析,鉴定了62种蛋白质.通过与已有的羊水和血浆蛋白质表达数据库比对,从中新发现22种只在羊水中表达的蛋白质,其中4种已知是子宫或妊娠特异的.本研究建立了nano LC/MS/MS对羊水进行蛋白组学分析的方法并发现了一些可能的羊水特异表达蛋白.

nanoLC-ESI/MS/MS在ECV304细胞蛋白质组学研究中的应用

目的:应用纳升液联用技术(nanoLC-ESI/MS/MS)对ECV304细胞蛋白质组学进行初步分析。方法:提取ECV304细胞总蛋白,经变性、还原、烷基化和酶解,nanoLC-ESI/MS/MS对酶解后的肽段进行分析,数据库(Swissprot)检索鉴定蛋白质,生物信息学工具对所鉴定的蛋白质进行细胞定位和功能分类。结果:从8μg细胞总蛋白中鉴定了120种蛋白质,所鉴定蛋白质的分子质量(MW)范围从6 648 D至280 739 D,MW<20 kD的蛋白质占24.2%,MW>100 kD的蛋白质占5.0%;主要位于细胞质、细胞骨架、细胞核和细胞膜,分别为27.8%、19.0%、15.2%和10.1%;大多为结构蛋白质和催化活性的蛋白质,分别为36.4%和34.1%,具有信号转导活性的占11.4%;其中角蛋白8、18和vimentin等为内皮细胞特异表达的蛋白质。结论:本研究建立了nanoLC-ESI/MS/MS分析ECV304细胞的蛋白质组学方法,为内皮细胞及内皮细胞损伤机制的蛋白质组学研究奠定了实验基础。

冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)原液(无人白)体积分子排阻-高效液相色谱主峰右侧峰2蛋白鉴定

目的对冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)原液(无人白)体积分子排阻-高效液相色谱(size exclusion chromatograghy-high performance liquid chromatography,SEC-HPLC)主峰右侧峰2蛋白进行鉴定,以明确该峰的蛋白成分,保证疫苗质量。方法将冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)原液(无人白)进行SEC-HPLC分析,收集主峰右侧峰2,经超滤浓缩后,进行二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT)还原、碘代乙酰胺(iodoacetamide,IAM)烷基化和胰蛋白酶(Trypsin)酶解,产物进行nanoLC-MS/MS串联质谱分析。结果冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)原液(无人白)SEC-HPLC主峰右侧峰2成功鉴定4个蛋白,单个蛋白匹配肽段数在59~79个之间;单个蛋白匹配特征肽段种数在6~12种之间;单个蛋白匹配特征肽段检出次数在20~36次之间;鉴定蛋白的序列覆盖率在37.40%~64.31%之间。参与统计的肽段共280个,质谱偏差均小于0.15 Da。结论冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)原液(无人白)SEC-HPLC主峰右侧峰2均来源于狂犬病病毒株4aGV,为疫苗颗粒解离物。

基于纳升高效液相色谱-线性离子阱-静电场轨道阱高分辨质谱技术研究蟾酥鲜品中的蛋白质

目的采用高分辨质谱方法研究蟾酥鲜品中的蛋白质。方法蟾酥鲜品蛋白经胰酶消化,利用纳升高效液相色谱-线性离子阱-静电场轨道阱(NanoLC-LTQ-Orbitrap)高分辨质谱技术对酶解多肽进行检测分析。Maxquant检索引擎鉴定蛋白[数据库为两栖纲蛋白序列(amphibia.fasta)]。结果鉴定了407种蛋白质和880种多肽序列。进一步采用基因本体论系统(gene ontology)中的PANTHER分析,对蟾酥鲜品的蛋白质组进行功能注释及分类。结论发现这些蛋白涉及多种信号通路,包括5-羟色胺(5-HT)受体介导通路,β肾上腺素能受体通路,血凝反应,钙信号通路和胆固醇合成与代谢等76种代谢路径。这为发现蟾酥鲜品中的蛋白质和其功能研究提供了实验依据。

纳升级反相液相色谱串联质谱法分析海马蛋白质组

目的:为了全面了解海龙的蛋白质成分,对其蛋白表达谱进行蛋白质组学分析。方法:应用三氯乙酸/丙酮沉淀法提取海马药材的蛋白质,经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离分析,将聚丙烯酰胺凝胶电泳条带切下进行胶内酶解处理后,应用纳升级反相液相色谱串联质谱(nano RPLC-MS/MS)法系统分析海马提取蛋白质胶内酶解产物,并进行数据库检索鉴定蛋白质。结果:共鉴定到海马蛋白192种,等电点范围为4.06~12.18,相对分子质量范围为3.06×10~3~3.52×10~6,多肽10 680个;通过生物信息学方法分析了海马提取蛋白质的分子功能。得到海马提取物中的蛋白质具有结合、酶催化、肌动、ATP酶等功能活性,其中结合活性的蛋白质占的比例较大。结论:本研究建立了海马的蛋白质表达谱,可为海马药材中蛋白质的深入研究奠定基础,对海马药材有效成分的分析和海马药材鉴别具有重要意义。

冻干人用狂犬病疫苗（Vero细胞）半成品SEC-HPLC左侧肩峰蛋白鉴定

目的对冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)半成品SEC-HPLC左侧肩峰蛋白进行鉴定。方法将人血白蛋白(human serum albumin,HSA)和疫苗半成品分别进行SEC-HPLC分析,收集左侧肩峰后进行烷基化,并用胰酶酶解,产物进行nanoLC-MS/MS分析。结果HSA SEC-HPLC左侧肩峰成功鉴定6个蛋白,包括1个HSA和5个非HSA蛋白;疫苗半成品SEC-HPLC左侧肩峰成功鉴定3个蛋白,包括1个HSA和2个非HSA蛋白,它们均在HSA SEC左侧肩峰中被鉴定。结论冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)半成品SEC-HPLC左侧肩峰蛋白来源于HSA。