东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂工蜂过程中nce-miR-10660及其靶基因表达谱

【目的】本研究旨在为探究nce-miR-10660调控东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae侵染的作用机制提供理论和实验依据。【方法】采用Stem-loop RT-PCR对前期鉴定到的东方蜜蜂微孢子虫nce-miR-10660进行表达验证,再通过Sanger测序验证nce-miR-10660的序列。利用相关生物信息学软件预测和分析nce-miR-10660的靶基因。通过RT-qPCR检测nce-miR-10660及其靶基因在东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica工蜂过程中中肠中的表达谱。【结果】Stem-loop RT-PCR和Sanger测序结果分别证实了nce-miR-10660在东方蜜蜂微孢子虫孢子中的表达和真实存在。靶向预测结果显示nce-miR-10660共靶向RRDRP和RCDP 42等9个基因;分别有2和6个靶基因可被分别注释到KEGG数据库中的4条通路和GO数据库中的23个条目。RT-qPCR结果显示,相较于东方蜜蜂微孢子虫侵染后1 d时意大利蜜蜂工蜂中肠中nce-miR-10660的表达量,东方蜜蜂微孢子虫侵染后2 d时意大利蜜蜂工蜂中肠中nce-miR-10660的表达量显著上调,在东方蜜蜂微孢子虫侵染后4,6和8 d时意大利蜜蜂工蜂中肠中nce-miR-10660的表达量均显著下调;东方蜜蜂微孢子虫侵染后4,6和8 d时意大利蜜蜂工蜂中肠中靶基因RRDRP的表达量均显著下调表达;东方蜜蜂微孢子虫侵染后2,4,6和8 d时意大利蜜蜂工蜂中肠中靶基因RCDP 42的表达量显著下调。【结论】nce-miR-10660在东方蜜蜂微孢子虫孢子中真实存在和表达;nce-miR-10660及其靶向的RRDRP和RCDP 42在东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂工蜂过程中差异表达;nce-miR-10660通过正调控RRDRP和RCDP 42表达潜在参与调节东方蜜蜂微孢子虫侵染。

东方蜜蜂微孢子虫nce-miR-11248及其靶基因SGT1的生物信息学和表达谱研究

【目的】对前期鉴定所获得的东方蜜蜂微孢子虫的nce-miR-11248进行表达和序列验证,预测、分析其靶基因,并检测nce-miR-11248及其靶基因在东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂工蜂过程中的表达谱,为进一步开展nce-miR-11248调控东方蜜蜂微孢子虫侵染的功能及作用机制研究提供参考。【方法】利用Stem-loop RT-PCR和Sanger测序验证nce-miR-11248的真实性;利用相关生物信息学软件预测nce-miR-11248的靶基因,并分析其编码蛋白的分子特性;使用MEME和TBtools软件预测SGT1蛋白的保守基序和结构域,通过Mega 11.0软件进行氨基酸序列多重比对,采用邻接法构建系统进化树。采集东方蜜蜂微孢子虫孢子侵染1,2,4,6和8 d的意蜂工蜂中肠组织,采用RT-qPCR检测nce-miR-11248及其靶基因SGT1的表达谱。【结果】nce-miR-11248在东方蜜蜂微孢子虫孢子中真实存在,其序列长度为25 bp。nce-miR-11248的靶基因为SGT1。SGT1蛋白分子式为C_(765)H_(1213)N_(195)O_(241)S_(4),分子质量约为17.10 ku,脂溶系数为82.67,等电点为5.50,亲水系数为-0.709,不含典型的信号肽和跨膜结构域,可同时定位于细胞核、线粒体和过氧化物酶体。东方蜜蜂微孢子虫、家蚕微孢子虫、泛胞虫、肠脑炎微孢子虫和蚱蜢脑炎微孢子虫的SGT1中均含有4个保守基序(Motif 1、Motif 2、Motif 3和Motif 4)和1个结构域(SGT1超家族结构域)。东方蜜蜂微孢子虫、家蚕微孢子虫、肠脑炎微孢子虫和蚱蜢脑炎微孢子虫的SGT1聚为一支,且东方蜜蜂微孢子虫与家蚕微孢子虫的SGT1进化距离最近。相较于侵染东方蜜蜂微孢子虫后1 d,侵染后2,4,6和8 d nce-miR-11248的表达量均显著下调(P<0.05);侵染后2,4,6和8 d SGT1的表达量均下调,其中侵染后4,6和8 d的表达量与2 d的差异达显著水平(P<0.05)。【结论】nce-miR-11248在东方蜜蜂微孢子虫孢子中真实存在;东方蜜蜂微孢子虫与家蚕微孢子虫的SGT1亲缘关系最近;随着侵染时间的延长,nce-miR-11248及其靶基因SGT1在东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂工蜂过程中的表达量均呈持续下降;nce-miR-11248和SGT1是潜在的参与调控微孢子虫侵染过程的因子。

东方蜜蜂微孢子虫侵染过程中nce-miR-15338及候选靶基因的表达谱

【目的】本研究旨在为探究nce-miR-15338调控东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)侵染意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica)工蜂的功能及作用机制提供参考和依据。【方法】采用Stem-loop RT-PCR和Sanger测序验证nce-miR-15338的存在和表达。利用相关软件预测nce-miR-15338的靶基因并进行数据库注释。通过RT-qPCR检测nce-miR-15338及其候选靶基因在东方蜜蜂微孢子虫侵染过程中的表达谱。【结果】nce-miR-15338在东方蜜蜂微孢子虫孢子中真实存在和表达;nce-miR-15338共靶向LCFAL 2和20s PS等16个基因;分别有16、7、8、3个靶基因可注释到Nr、Swiss-Prot、GO和KEGG数据库;相较于接种后1 d,nce-miR-15338的表达量在2 d极显著上调,在4、6、8 d均极显著下调;LCFAL 2的表达量在接种2、4、6、8 d后皆为极显著下调;20s PS在接种2、4、6、8 d的表达水平均为极显著下调。【结论】研究结果证实了nce-miR-15338的真实存在和表达,并明确了东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂工蜂过程中nce-miR-15338及其候选靶基因LCFAL 2和20s PS的表达规律。

东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂工蜂过程的nce-miR-23928及其靶基因表达谱

【背景】东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)专性侵染成年蜜蜂中肠上皮细胞而导致的微孢子虫病给养蜂业造成严重损失。【目的】检测东方蜜蜂微孢子虫nce-miR-23928及其靶基因在侵染意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica)工蜂过程的表达谱,为深入探究nce-miR-23928在东方蜜蜂微孢子虫侵染中的功能及调控机制提供依据。【方法】通过RNAhybrid、miRanda和TargetScan软件预测nce-miR-23928的靶基因。使用BLAST工具将上述靶基因比对到基因本体论(geneontology,GO)、京都基因和基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)、Nr和Swiss-Prot数据库以获得相应注释。采用实时荧光定量PCR(real time quantitative PCR,RT-qPCR)技术检测nce-miR-23928及其靶基因在东方蜜蜂微孢子虫侵染意蜂工蜂过程中的相对表达量。【结果】相较于接种后1 d(1 day post infection,1 dpi),nce-miR-23928的表达量在2 dpi基本不变,而在4、6、8 dpi均为显著下调(P<0.05),总体表现出下降的表达趋势。预测到nce-miR-23928的15个靶基因,分别有9、4、15和9条靶基因可注释到GO(3个条目)、KEGG(7条通路)、Nr和Swiss-Prot数据库。与1 dpi相比,靶基因ABCT的表达量在2、4、6、8 dpi皆显著下调;靶基因SPTK的表达量在4、6、8 dpi均显著上调。【结论】明确nce-miR-23928及其靶基因ABCT和SPTK在东方蜜蜂微孢子虫侵染意蜂工蜂过程中的动态表达规律,揭示nce-miR-23928通过正调控ABCT表达和负调控SPTK表达可能在东方蜜蜂微孢子虫的侵染过程中起调节作用。

东方蜜蜂微孢子虫侵染过程中nce-miR-34537和靶基因PIP5KI的表达谱

【目的】本研究旨在对前期鉴定到的nce-miR-34537进行表达和序列验证,预测nce-miR-34537的靶基因并明确其分子特性,进而检测nce-miR-34537及其靶基因在东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)侵染意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica)工蜂过程的表达谱,为进一步探究nce-miR-34537调控东方蜜蜂微孢子虫侵染的功能和作用机制提供基础。【方法】通过Stem-loop-RT-PCR和Sanger测序验证nce-miR-34537的表达和序列。通过生物信息学软件预测nce-miR-34537的靶基因PIP5KI(I型磷脂酰肌醇4-磷酸-5-激酶基因)的理化性质等分子特性和保守基序,并构建基于氨基酸序列的系统进化树。采用RT-qPCR检测nce-miR-34537及其靶基因的表达谱。【结果】nce-miR-34537在东方蜜蜂微孢子虫孢子中真实存在和表达。nce-miR-34537共靶向PIP5KI等151个基因。PIP5KI蛋白的分子式为C882H1364N226O251S7,分子量约为19.37 kDa,含160个氨基酸和17个磷酸化位点,但不含信号肽,可同时定位于细胞核、线粒体、细胞质和分泌囊泡。东方蜜蜂微孢子虫的1个PIP5KI(AAJ76_2700017870)含4个保守基序,另1个PIP5KI(EEQ82436.1)含5个保守基序。东方蜜蜂微孢子虫、蜜蜂微孢子虫(N.apis)和鮟鱇思普雷格孢虫(Spraguea lophii)的PIP5KI在进化树中聚为一支,且东方蜜蜂微孢子虫的PIP5KI(EEQ82436)与蜜蜂微孢子虫的PIP5KI(EQB60549.1)的进化距离最近。相较于接种后1 dpi(day post inoculation),nce-miR-34537在2 dpi上调表达(P>0.05),而在4 dpi、6 dpi和8 dpi的表达量均显著下调(P<0.05);PIP5KI在2 dpi表达量显著上调(P<0.05),在4 dpi、6 dpi和8 dpi的表达量均显著下调(P<0.05)。【结论】nce-miR-34537在东方蜜蜂微孢子虫孢子中真实存在和表达,东方蜜蜂微孢子虫的PIP5KI(EEQ82436)与蜜蜂微孢子虫的PIP5KI(EQB60549.1)之间亲缘关系最近,nce-miR-34537及其靶基因PIP5KI在东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂工蜂过程中均表现出上升-下降的表达规律,nce-miR-34537通过正调控PIP5KI表达潜在参与调节侵染过程。

东方蜜蜂微孢子虫侵染过程中nce-miR-15325及其靶基因NCCS和DTⅢ分析

【目的】东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae侵染蜜蜂导致微孢子虫病,但侵染机制未明。本研究拟在前期工作基础上,验证nce-miR-15325的相对表达量及序列信息,并进一步检测nce-miR-15325及其靶基因在东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂Apismelliferaligustica工蜂过程的相对表达量,为进一步探究nce-miR-15325调控侵染的功能和机制提供依据。【方法】利用Stem-loopRT-PCR和Sanger测序对nce-miR-15325进行相对表达量及序列信息验证。利用相关生物信息学软件对nce-miR-15325的靶基因进行信息预测及分析。通过RT-qPCR检测nce-miR-15325及其靶基因的相对表达量。【结果】鉴定到在东方蜜蜂微孢子虫孢子中nce-miR-15325真实存在并表达。预测到nce-miR-15325的11个靶基因,其中分别有3、4、7和4个靶基因可注释到KEGG、GO、Nr和Swissprot数据库。与接种后1 d相比,nce-miR-15325在2 dpi(day post inoculation,dpi)的表达量变化不显著,而在4、6和8 dpi时,相对表达量均显著下调(P<0.05),总体表达趋势呈下调。相较于1 dpi,靶基因NCSS在2、4、6和8 dpi的表达量均显著下调(P<0.05);类似的,靶基因DTⅢ在2、4、6和8dpi的表达量均显著下调(P<0.05),总体上表现出下降的表达趋势。【结论】证实了东方蜜蜂微孢子虫孢子中nce-miR-15325存在和表达的真实性,明确了在东方蜜蜂微孢子虫侵染过程的nce-miR-15325及其靶基因的动态表达模式,揭示nce-miR-15325通过正调控NCSS和DTⅢ表达潜在调节侵染过程。