长链非编码RNA-NEF在肝癌、胃癌、食管癌发生发展中的作用

长链非编码RNA(lncRNA)是一类长度>200个核苷酸且不编码蛋白质的RNA,通过与RNA和DNA相互作用来调节基因表达,其功能与亚细胞定位密切相关。在细胞核中,lncRNA在表观遗传和转录水平上调节基因表达;在细胞质中,其在转录后和翻译水平上调节基因表达。lncRNA作为外泌体的一种,其异常表达已被证实具有肿瘤抑制或致癌作用,并在肿瘤的增殖、凋亡、免疫逃逸等生物学过程中发挥重要作用。lncRNA-NEF是一种在肝癌中新发现的lncRNA,具有抑制肝癌上皮间质转化及转移的作用。后续研究发现,lncRNA-NEF在多种肿瘤中发挥作用,且主要表现为抑癌作用。消化系统恶性肿瘤发病率高,预后差,生存期短,本文就lncRNA-NEF的主要特征及其在肝癌、胃癌、食管癌中的作用进展进行综述,以期为发现新的肿瘤诊断标志物及预后指标提供依据,并且为其治疗提供新思路,开辟肿瘤治疗新靶点。

HIV-1病毒Nef基因克隆、表达、纯化及其抗体的制备

目的:运用基因工程方法制备HIV-1 Nef重组蛋白及其抗体。方法:用PCR技术从HIV-1H×B2质粒中扩增HIV-1 Nef基因,将测序鉴定过的HIV-1 Nef基因克隆到原核表达载体pET28a(+)上,应用酶切鉴定、测序、SDS-PAGE及Western blot等方法鉴定基因片段的正确性及表达蛋白的特异性。纯化的重组蛋白免疫兔3次后,ELISA法测定兔多克隆抗体滴度。用其制备的多克隆抗体通过免疫组织化学方法测定表达Nef基因的内皮细胞。结果:成功地构建了Nef基因的原核表达质粒,测序证明HIV-1Nef基因全长为621bp,编码206个氨基酸。在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达的重组蛋白为包涵体的形式。HIV-1 Nef蛋白N端融合6×His标签便于纯化及鉴定。获得的高纯度HIV-1 Nef融合蛋白,免疫动物后,可产生特异的高滴度抗体(ELISA滴度达1∶10000)。将转染Nef基因的内皮细胞,应用免疫组化的方法证明其抗体有高度的特异性。结论:构建了高表达HIV-1 Nef蛋白的原核表达系统,制备的Nef重组蛋白免疫动物,获得了特异、高效价的抗体,为研究Nef基因的生物学活性提供了实验材料和依据。

HIV-1Nef调节内皮细胞黏附分子ICAM-1的表达

目的研究HIV-1的调节基因Nef对ECV304细胞ICAM-1表达的影响,从而为分析HIV-1感染引起内皮细胞生物学活性的变化,以及为阐明Nef参与HIV-1致病的分子机制奠定基础。方法应用本实验室已经建立保存的HIV-1Nef基因在内皮细胞的稳定表达细胞株ECV304-Nef和其阴性对照细胞株ECV304 pcDNA 3.1(+),通过RT-PCR、实时定量PCR(real-time PCR)、Western blot、FCM和细胞黏附试验分析ECV304-Nef细胞ICAM-1的表达水平。结果 RT-PCR、real-time PCR结果显示ECV304-Nef细胞ICAM-1 mRNA表达水平明显升高,为对照组的(4.3±0.2)倍;Western blot结果示ECV304-Nef细胞I-CAM-1蛋白的表达水平高于对照组;FCM分析显示ECV304-Nef细胞和对照组细胞ICAM-1阳性细胞百分率分别为(35.3±2.2)%和(12.5±0.8)%(P<0.01),两组间ICAM-1表达有显著差异。细胞黏附实验观察到ECV304-Nef细胞黏附的Jurkat细胞数明显多于对照组,荧光仪定量分析结果显示ECV304-Nef细胞黏附的Jurkat细胞的荧光强度值显著高与对照组(P<0.05)。结论本实验证实了HIV-1Nef基因可以上调血管内皮细胞细胞黏附分子ICAM-1的表达。

HIV-1 Nef通过Erk/Mapk途径调节内皮细胞黏附分子ICAM-1的表达

目的:研究HIV-1Nef基因对内皮细胞ECV304细胞ICAM-1表达的影响及其信号途径。方法:选用Nef基因稳定表达细胞株ECV304-Nef和对照细胞株ECV304pcDNA3.1(+),应用Westernblot分析ECV304-Nef细胞ERK的磷酸化水平,利用ERK磷酸化抑制剂通过Westernblot、流式细胞术分析ECV304-Nef细胞ICAM-1的表达水平与信号分子ERK磷酸化的相关性。结果:Westernblot显示ECV304-Nef细胞ICAM-1和p-ERK蛋白的表达水平均高于对照组;流式细胞术检测结果表明ECV304-Nef细胞和对照组ICAM-1阳性细胞百分率分别为(35.3±2.2)%和(12.5±0.8)%(P<0.01)。加入p-ERK抑制剂PD98059后,ECV304-Nef细胞p-ERK水平被显著抑制,ICAM-1降至对照组水平,ECV304-Nef细胞和对照组细胞ICAM-1阳性细胞百分率分别为(11.4±1.1)%和(10.4±1.5)%(P>0.05)。结论:HIV-1Nef基因上调血管内皮细胞细胞黏附分子ICAM-1的表达与ERK信号分子磷酸化有关,为HIV-1感染的致病机制及临床治疗提供实验基础。

非复制重组痘苗病毒表达人免疫缺陷病毒Bostwana C亚型Nef蛋白及免疫效果的观察

从含人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV 1)BostwanaC亚型全基因的质粒pJM4 HIV中克隆了nef基因,并利用非复制型痘苗病毒载体构建表达Nef蛋白的重组病毒NTVJ1175nef,经PCR和Southernblot鉴定,nef基因正确整合到痘苗病毒基因组的J片段上;感染人源细胞后,经Westernblot和免疫荧光检测表明,重组病毒能很好地表达Nef蛋白,并定位于细胞质中。NTVJ1175nef免疫BALB/c小鼠后,经Pep IFN ′γ Assay法检测,可诱导产生针对表位肽P1特异的可分泌IFN ′γ的CD+8T细胞(占脾细胞总数0 20%);经乳酸脱氢酶(LDH)法检测证实,诱导的细胞毒性T细胞(CTL)可特异性地杀伤表位肽P1特异P815靶细胞。这些结果表明,NTVJ1175nef具有良好的细胞免疫原性,为下一步构建表达包含HIV早期抗原的多组分重组痘苗病毒候选疫苗奠定了免疫学基础。

重组慢病毒载体介导HIV-1 Nef蛋白对原发性渗出性淋巴瘤细胞系和血管内皮细胞增殖作用影响的初探

目的:构建含有HIV-1负调控因子(Nef)基因的重组慢病毒表达载体,并检测Nef蛋白在人胚肾293T细胞、体腔渗出性淋巴瘤细胞BCBL-1和人血管内皮细胞EA.hy926中的表达情况及其对BCBL-1和EA.hy926细胞增殖的影响。方法:从本实验室已构建好的含Nef基因的重组真核表达质粒pCI-neo-Nef中扩增出Nef基因,插入到慢病毒载体pHAGE-CMV-MCS-Izs-Green中构建成pHAGE-Nef,利用脂质体将其与包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共转染293T细胞。荧光显微镜下观察293T细胞中绿色荧光蛋白(GFP)的表达并收集培养上清,此上清经0.45μm滤器过滤后即获得慢病毒悬液。梯度稀释法测定慢病毒滴度。将重组慢病毒分别感染293T、BCBL-1和EA.hy926细胞,用Western blot检测Nef蛋白的表达。通过细胞增殖实验检测Nef蛋白对BCBL-1和EA.hy926细胞增殖的影响。结果:限制性内切酶鉴定和核酸序列测序证实成功构建了含HIV-1 Nef基因的重组慢病毒表达载体,病毒滴度为1×107 TU/ml。以重组慢病毒分别感染293T、BCBL-1和EA.hy926细胞,均能检测到Nef蛋白的表达,且Nef蛋白能够抑制BCBL-1和EA.hy926细胞的增殖作用。结论:成功构建了含HIV-1 Nef基因的慢病毒表达载体,获得的慢病毒不仅能够有效感染293T、BCBL-1和EA.hy926细胞,而且能够介导Nef蛋白在这些细胞中表达。重组慢病毒载体介导的Nef蛋白能够抑制BCBL-1和EA.hy926细胞的增殖。

HIV-1C亚型调控蛋白Nef在大肠杆菌中的表达

目的表达人免疫缺陷病毒1型C亚型调控蛋白Nef,为研制HIV疫苗寻找新的途径。方法通过PCR扩增,获得HIV-1C亚型Nef基因片段,并将其克隆到原核表达载体pGEX-5X-1中,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达后,以SDS-PAGE和Westernblot分析表达产物。结果表达产物是相对分子质量为50000的GST融合蛋白,且能与p27单克隆抗体发生特异性反应。结论重组Nef蛋白在大肠杆菌中得到了有效表达。

早期半定量检测HIV-1 nef RNA的水平

目的 早期半定量检测HIV - 1nefRNA。方法 以nef基因引物nef6 ,nef7和β-actin基因引物BA1,BA4 在同一反应体系中对标本进行逆转录聚合酶链反应 ,用BIO - 1D软件对条带密度进行分析 ,半定量测定HIV - 1nefRNA水平。结果 所试 7例实验标本均扩增出HIV - 1nef和 β -actin的基因产物。且通过BIO - 1D软件分析条带密度 ,判断艾滋病病毒感染情况。结论 该方法灵敏 ,简便 ,经济 。

利培酮氯丙嗪对首发精神分裂症患者眼动分析NEF的影响

目的探讨眼动分析中凝视点数和反应性探索分析能否作为首发精神分裂症患者的诊断和治疗效果的客观依据以及这两种指标是否受不同抗精神病药物治疗的影响。方法将符合入组标准的53例精神分裂症患者随机分为氯丙嗪组24例、利培酮组29例进行治疗,疗程6w。随机抽取30例正常健康者为对照组,于患者组治疗前及治疗6w末测评三组眼动分析中凝视点数来分析其认知功能的改善情况。结果氯丙嗪组、利培酮组眼动分析中凝视点数评分均显著低于对照组(P<0.01),治疗6w末凝视点数评分虽有显著升高(P<0.01),但仍均显著低于对照组,差异均有极显著性(P<0.01)。结论凝视点数测评可作为首发精神分裂症患者诊断和判定疗效的客观依据,并且可能受药物的影响。

抗Nef蛋白单抗的制备与鉴定及应用——Ⅰ:应用合成Nef蛋白肽分析抗Nef蛋白单抗的特异性

本文报告了应用杂交瘤技术制备出97个鼠抗HIV重组Nef蛋白的单抗,并应用24个按Nef蛋白氨基酸顺序合成的部分重叠的肽(Over lapping peptides)鉴定其肽特异性以及采用“肽扫描”(Pepscan;Pin ELISA)法进一步研究单抗的抗原表位特异性。文中对合成肽在抗原性分析以及抗蛋白单抗的肽特异性和表位特异性鉴定上的应用与优点进行了讨论。

应用人工合成的HIV nef蛋白肽制备抗nef单抗

本文用人工合成的HIV nef蛋白肽免疫Belb/c小鼠,应用活体融合法制备了11个抗nef单克隆抗体。ELISA测定表明,11个单抗均能与nef肽和nef蛋白反应,其中3、7、9、10和11号抗体与nef肽和nef蛋白的反应性相近似;4、5、6和7号抗体与nef蛋白的反应性明显比肽强。所有单抗均不与HIV的其它蛋白反应。应用免疫荧光检测抗nef单抗与HIV感染细胞的反应性表明,大部分抗体均与细胞浆着色,而无一般膜荧光的典型征象。

人类免疫缺陷病毒-1 nef诱导凋亡及下调人类白细胞抗原-I类分子

【目的】研究人类免疫缺陷病毒(HIV)-1 nef调节细胞表面的人类白细胞抗原(HLA)-I类分子及诱导细胞凋亡情况。【方法】将293T细胞分为两组,用脂质体法将含HIV-1 nef基因的质粒及空载体分别转染细胞,Western blot检测HIV-1 nef在转染细胞中的表达,荧光抗体染色结合流式细胞术检测细胞表面的HLA-I类分子表达及细胞凋亡情况。【结果】HIV-1 nef在转染细胞中有表达。转染HIV-1 nef的细胞与转染空载体的细胞经抗HLA-A,B,C-FITC染色后,平均荧光强度分别为205±22及269±15,两者相比有显著性差异(P<0.01);经Annexin V-APC/PI染色后,阳性细胞百分率分别为(60.82±8.32)%及(8.12±5.43)%,两者相比亦有显著性差异(P<0.01)。【结论】HIV-1 nef下调细胞表面的HLA-I类分子及诱导细胞凋亡。

HCK SH3结构域与HIV-1 Nef蛋白体外结合活性的检测

目的构建重组原核表达质粒pGEX-4T-1/SH3,检测原核表达的SH3蛋白的生物学活性。方法利用PCR方法扩增HCK SH3基因,并将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中,构建原核表达质粒pGEX-4T-1/SH3,转化E.coli DH5α,进行双酶切和测序鉴定。筛选阳性质粒,转化至E.coli BL21(DE3)中进行表达,对表达产物进行SDS-PAGE和蛋白质印迹检测,同时纯化SH3蛋白。表达并纯化HIV-1 Nef蛋白,利用GST pull-down方法检测SH3蛋白与Nef蛋白的结合活性。结果成功获得重组质粒pGEX-4T-1/SH3,测序正确,高效表达并纯化了SH3蛋白。GST pull-down实验结果显示SH3与HIV-1 Nef蛋白具有良好的结合活性。结论成功地克隆、表达和纯化了GST-SH3蛋白,SH3与Nef蛋白具有体外特异性结合活性,为进一步研究针对Nef与SH3结合的靶向药物的筛选提供了实验基础。

基于Nef的组网雷达包络三维可视化研究

提出了采用基于CGAL库定义的Nef多面体数据结构,并结合Nef多面体之间的三维布尔操作来解决组网雷达探测范围相互重叠的雷达包络可视化问题。试验测试结果表明,每组试验样本求交后的三角网格正常,可视化效果好,满足项目应用需求。

HIV-1 Nef基因在THP-1细胞的表达和活性检测

目的将HIV-1 Nef基因转染THP-1细胞,获得稳定表达Nef蛋白的细胞克隆,为研究Nef对巨噬细胞生物学活性的影响奠定实验基础。方法将质粒pcDNA3.1(+)-Nef和pcDNA3.1(+()阴性对照)转染THP-1细胞,通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot、细胞免疫荧光等方法检测目的蛋白在真核细胞内的表达及定位,采用共转染法将荧光报告基因转染THP-1Nef和THP-13.1细胞,通过测定荧光(RLU)值来评价Nef蛋白的生物学活性。结果转染细胞经G418筛选后获得稳定表达Nef的THP-1细胞株,RT-PCR及Western blot结果表明Nef在真核细胞中成功表达,细胞免疫荧光结果显示,THP-1-Nef细胞表达的Nef蛋白主要定位于细胞质中。荧光酶标仪检测转染了HIV-1LTR-Luc和NFκB-Luc荧光报告基因的THP-1-Nef和THP-1-3.1细胞的RLU值。结论成功建立了THP-1-Nef细胞稳定表达细胞株,检测了其生物学活性,为进一步研究其作用机制实验奠定基础。

HIV-1 Nef重组重叠肽诱导小鼠免疫保护作用研究

目的探讨HIV-1 Nef重组重叠肽诱导小鼠细胞免疫应答的效果。方法以HIV-1 LAI Nef重组重叠肽和相应蛋白免疫接种BALB/c和C57BL/10小鼠,每组5例,分离小鼠脾单个核细胞(spleen mononuclear cell,SMC),以ELISPOT和流式细胞术检测特异性细胞应答,以大剂量Nef重组痘苗病毒攻击试验检测重组重叠肽对免疫小鼠的保护作用。结果在C57BL/10小鼠中,佐剂组ELISPOT为阴性,重叠肽组和相应蛋白组LAI Nef特异性细胞免疫应答分别为(145.7±36.2)SFU/106SMC和(24.2±10.2)SFU/106SMC(P=0.001),在BALB/c小鼠中分别为(148.8±50.4)SFU/106SMC和(19.8±9.0)SFU/106SMC(P=0.004),而NL4-3 Nef特异性细胞免疫应答分别为(104.0±33.8)SFU/106SMC和(20.7±9.5)SFU/106SMC。重组重叠肽疫苗诱导的Nef特异性CD4+和CD8+细胞的百分比分别为1.53和0.80。在攻毒试验中,重叠肽组、蛋白组、佐剂组和空白对照组的生存率分别为80%、40%、20%和0%。结论重组重叠肽免疫小鼠可产生具有保护作用的较强的广谱特异性细胞免疫应答,对于不同株系的Nef具有交叉反应,重组重叠肽的免疫接种效果强于相应蛋白。

nef RNA在人类免疫缺陷病毒早期感染检测中的应用

目的 为进行人类免疫缺陷病毒 (HIV)早期感染的检测 ,预防医院感染。方法 以 nef基因引物 nef6,nef7和 β-肌动蛋白 (actin)基因引物 BA1 ,BA4在同一反应体系中对标本进行逆转录聚合酶链反应 ,用 Kodak DigitalScience1D软件对条带密度进行分析 ,并对 PCR产物进行 Southern印迹杂交 ,以确定 PCR反应所得条带为 nef基因扩增产物。结果 所检测的 6例 HIV- 1抗体阴性 P2 4抗原阳性患者标本均扩增出 HIV- 1nef和 β-肌动蛋白的基因产物 ,通过 Kodak Digital Science1D软件分析得到各标本条带的密度比值 ,Southern印迹杂交证明 PCR反应条带确实为 HIV- 1nef基因扩增片段。结论 该方法简便、经济 ,可作为 HIV早期感染检测的一种辅助手段 ,防止医院内

人免疫缺陷病毒早期蛋白Nef的表达、纯化及免疫原性研究

目的:通过原核细胞表达人免疫缺陷病毒(HIV)Nef抗原,制备特异抗血清,为Nef抗原检测提供技术方法。方法:以HIV Botswana毒株基因组为模板,用PCR法获得Nef蛋白编码基因,将其克隆到pET30a载体中,在大肠杆菌中表达Nef融合蛋白;用纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠获得抗血清,用真核表达的Nef抗原对其特异性进行分析。结果:构建的Nef融合基因在大肠杆菌中获得表达,相对分子质量约为36×103,免疫BALB/c小鼠获得针对融合蛋白的高效价抗血清,ELISA抗体滴度为1∶6400;免疫荧光和Western blot检测表明,该抗血清能特异地与重组痘苗病毒表达的Nef抗原反应。结论:在大肠杆菌中表达了HIV Nef融合蛋白,制备了Nef融合蛋白的高效价小鼠免疫血清,该血清能特异性识别HIV Nef抗原,为HIV Nef抗原检测提供了技术方法。

黑龙江省服刑人员HIV-1nef基因分析

目的研究黑龙江省服刑人员中HIV-1感染者病毒流行株的起源及其序列变异特征。方法采集黑龙江省16例感染HIV-1服刑人员的抗凝全血,分离血浆,用巢式聚合酶链反应对HIV-1附属基因(nef)进行扩增,并直接进行序列测定。应用BioEdit和MEGA软件进行序列及系统发育分析。结果系统进化树显示12例体内HIV的nef区序列属于泰国B亚型,3例属于重组型BC,1例属于重组亚型AE。各隔离株nef区的组内基因距离为13.53%。按传播途径分组,各组基因距离差异无统计学意义(P>0.05),表明nef区序列变异可能与传播途径无关。与国际标准株(HBX2)进行比较时,可发现某些nef序列的氨基酸变异。但是,大多数序列还是有较好的保守性。结论本组HIV-1病毒株可能有共同的起源,本文所讨论的氨基酸序列有望对nef功能区的未来研究提供参考信息。

HIV-1NefR作用机制的研究进展

人类免疫缺陷病毒（HIV）在病毒学上属于逆转录病毒科,慢病毒属。目前发现两种HIV,分别为人类免疫缺陷病毒-1（HIV-1）和人类免疫缺陷病毒-2（HIV-2）,两者具有相似的病毒结构和传播途径。HIV-2毒力和传播力都低于HIV-1,它引起的艾滋病（AIDS）病程也较缓和。HIV-1是目前引起全世界AIDS流行的主要病原,