shRNA表达载体pWH1的构建及用于HIF1基因的沉默

目的:构建用于RNAi的shRNA(small hairpinRNA)表达载体及检测其对低氧诱导因子-1(Hypoxia-inducibleFactor-1,HIF1)基因的沉默效果。方法:从人血基因组中PCR扩增出H1基因启动子,克隆入酶切处理后的pEGFP-C1载体片段中,此载体命名为pWH1。以人HIF1cDNA基因为靶标设计引物,退火后克隆入pWH1。新的载体转染SGC7901细胞,然后用RT-PCR和Western blot检测HIF1基因的表达改变。结果:构建的pWH1载体能很好地表达针对HIF1基因的shRNA,RT-PCR和Western blot的结果显示HIF1基因的mRNA和蛋白表达水平均明显下降。结论:成功构建了shRNA表达载体pWH1,这对于基因的功能研究具有重要的意义。

靶向EZH2基因的shRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的构建靶向EZH2基因的shRNA真核表达载体质粒,为利用RNA干扰技术探索EZH2基因的作用的研究做准备。方法根据EZH2 mRNA序列设计并合成shRNA寡核苷酸片段,退火形成双链并连接入pGenesil-2载体,并进行酶切鉴定和测序。结果酶切证明构建的shRNA已插入载体中,经测序证明与设计相同。结论成功构建靶向EZH2基因的shRNA真核表达载体,为进一步研究EZH2基因在肿瘤细胞中的作用机制及后续的体内外RNAi实验研究奠定了基础。

靶向HIWI基因的shRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的构建靶向HIWI基因的shRNA真核表达载体质粒,为利用RNA干扰技术探索HIWI基因的作用的研究做准备。方法根据HIWI mRNA序列设计并合成shRNA寡核苷酸片段,退火形成双链并连接入pGenesil-2载体,并进行酶切鉴定和测序。结果酶切证明构建的shRNA已插入载体中,经测序证明与设计相同。结论成功构靶向HIWI基因的shRNA真核表达载体,为进一步研究HIWI基因在干细胞和肿瘤细胞中的作用机制及后续的体内外RNAi实验研究奠定了基础。

靶向akirin2基因shRNA真核表达载体的构建及其干扰效率的测定

为了抑制C2C12细胞中akirin2基因的表达,试验采用siRNA表达载体法构建了靶向akirin2基因的RNA干扰(RNAi)真核表达载体。首先针对akirin2基因设计并合成了相应的干扰序列,退火后将其与RNAi表达载体psiRNA-h7SKGFPzeo进行连接,构建成干扰载体akirin2-pshRNA0、akirin2-pshRNA1。将构建好的载体通过Turbofect转染试剂转染小鼠成肌细胞C2C12,通过荧光定量PCR检测其干扰效率,经酶切和测序鉴定所构建的akirin2基因RNA干扰载体与设计序列完全相符。结果表明:重组干扰载体akirin2-pshRNA0和akirin2-pshRNA1构建成功。将重组RNAi载体转染C2C12细胞,与正常对照组相比,转染akirin2-pshRNA1组的akirin2基因mRNA相对表达量显著降低,表达量下调了60.62%(P<0.05)。说明试验构建的靶向akirin2基因的RNAi载体akirin2-pshRNA1可以有效地抑制C2C12细胞中akirin2基因的表达。

靶向mdr1基因shRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的:设计并构建靶向mdr1基因shRNA真核表达质粒。方法:以mdr1为靶基因设计具有短发夹结构的模板寡核苷酸,退火形成互补双链结构,再克隆至pSilencerTM3.1-H1neo载体,构建重组的短发夹shRNA表达载体。采用酶切法和测序法鉴定。结果:经限制性内切酶酶切电泳后显示有66bp模板寡核苷酸片段和4.3kbp的线性化的pSilencerTM3.1-H1neo载体片段。重组子测序结果与Genebank中的mdr1基因cDNA序列相符。结论:重组靶向mdr1基因shRNA表达载体构建正确,为进一步转染耐药的肿瘤细胞逆转肿瘤耐药研究奠定了基础。

shRNA靶向沉默HSV-2 UL54基因在HEK293细胞内的表达

根据乙型单纯疱疹病毒(HSV-2)UL54基因序列,设计并合成特异性的小干扰片段,将其定向克隆至真核表达载体p GPU6/GFP/Neo中,经脂质体介导转染HEK293细胞,倒置荧光显微镜和流式细胞仪检测转染效率,MTT法检测HEK293细胞的存活率,RT-PCR检测UL54基因m RNA的表达,Western blot检测UL54基因编码蛋白质的表达,终点滴定法测定细胞上清液中的病毒感染滴度。结果显示,sh RNA1081能抑制UL54基因m RNA和蛋白质的表达,能显著降低子代病毒滴度,提高细胞的存活率。表明本研究构建的重组表达载体p GPU6/GFP/Neo-UL54 sh RNA能在HEK293细胞中表达,并抑制HSV-2复制。

shRNA表达载体对HSV-2 ICP4基因的干扰效应

目的构建针对Ⅱ型单纯疱疹病毒(HSV-2) ICP4基因的短发夹RNA(shRNA)重组表达载体,探究该载体表达的shRNA对HSV-2的抑制作用。方法重组表达载体通过脂质体转染法转染HEK293细胞,并接种HSV-2,48h后,实时荧光定量RT-PCR检测mRNA转录情况,Western blot检测ICP4蛋白的表达情况,终点滴定法测定病毒的滴度。结果与对照组相比,干扰组对mRNA抑制率为71%,使蛋白表达减少71.81%,并且病毒滴度也明显降低(P<0.05)。结论构建的pGPU6/Neo-shRNA ICP4重组质粒表达载体能在体外细胞水平上干扰HSV-2 ICP4的基因表达,抑制HSV-2在细胞中复制。

Prohibitin基因的shRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的:构建靶向prohibitin基因的shRNA真核表达载体.方法:根据prohibitin mRNA序列,利用Ambion网上设计软件设计两条针对该基因不同靶点的shRNA干扰序列,克隆到线性化的质粒载体上,并进行酶切鉴定和测序.结果:酶切结果表明构建的shRNA已插入载体,经测序证明与设计一致.结论:成功构建两个靶向prohibitin基因的shRNA真核表达载体,为下一步研究prohibitin基因在肿瘤细胞中的作用和后续的的体内外实验奠定了基础.

靶向CCR7基因shRNA表达载体的构建及鉴定

目的设计并构建靶向CCR7基因shRNA真核表达质粒,并检测其干扰效果。方法以CCR7为靶基因设计具有短发夹结构的模板寡核苷酸,退火形成互补双链结构,再克隆至pGC-silencer-CRM30载体,构建的3条重组短发夹shR-NA表达载体分别命名为pGC-silencer-CRM30-CCR7A、-CCR7B和-CCR7C。采用测序法鉴定寡核苷酸序列。将构建好的真核表达载体转染人结肠癌SW480细胞,荧光显微镜观察转染效果,RT-PCR法检测CCR7干扰效率。结果重组质粒测序结果与Genebank中的CCR7cDNA序列相符,转染SW480细胞后,荧光显微镜下可观察到绿色荧光蛋白,RT-PCR结果表明,pGC-silencer-CRM30-CCR7C干扰效果最强。结论靶向CCR7基因shRNA表达载体构建无误,为进一步探讨趋化因子受体CCR7在胃肠道恶性肿瘤生物学行为中的作用奠定了基础。

大鼠Pik3cb shRNA质粒的构建及鉴定

目的构建大鼠Pik3cb短发卡状RNA(shRNA)真核表达载体,为利用RNA干扰技术(RNA interference,RNAi)从转录后水平抑制移植术后血管再狭窄的研究做准备。方法根据大鼠Pik3cb mRNA序列设计6条并经预实验挑选出2条shRNA寡核苷酸片段,退火形成双链并克隆进入载体pGenesil-1,进行酶切鉴定和测序。结果酶切证明构建的shRNA已插入载体,经测序证明与设计的相同,获得大鼠Pik3cb shRNA表达载体质粒。结论成功构建了2条大鼠Pik3cb shRNA真核表达载体,为靶向Pik3cb的RNAi防治血管再狭窄奠定了基础。

组蛋白赖氨酸转移酶KAT6B基因shRNA慢病毒载体的构建与鉴定

目的在乳腺癌细胞T47D中利用构建的短发卡RNA(shRNA)慢病毒载体对赖氨酸乙酰转移酶6B(KAT6B/MORF)基因进行RNA干扰,通过下调该基因的表达来研究其对乳腺癌细胞的抑制功能。方法针对KAT6B基因的CDS区合成2对单链的短发卡RNA(shRNA5、shRNA8)及相应的对照组序列(Scramble5、Scramble8),通过聚合酶链式反应(PCR)扩增后,与双酶切(EcoRl、Xhol)线性化处理的入门载体(pENTR/p SM2(CMV)GFP)同源重组,获得含有目的片段的入门克隆。再通过Gateway系统的LR克隆反应,将目的片段重组到目的载体(pLenti x1 puroDEST)上。利用慢病毒包装系统,将慢病毒包装质粒分别与构建好的两对目的质粒共转染到HEK-293T细胞中,收集病毒上清,转导乳腺癌细胞T47D。最后,通过免疫印迹法(Western blot)检测KAT6B的表达。结果对转化获得的单菌落进行测序鉴定,与目标序列完全一致,表明已经成功构建慢病毒载体。Western blot结果显示KAT6B基因的蛋白表达量在每组shRNA中都比相应的对照组显著降低,表明构建的基因沉默载体在乳腺癌细胞T47D中对KAT6B基因具有基因沉默作用。结论本研究通过构建KAT6B基因的shRNA慢病毒基因沉默载体,在乳腺癌细胞T47D中对KAT6B基因进行RNA干扰的研究,为进一步研究KAT6B基因在乳腺癌中发挥肿瘤抑制作用奠定了基础。

人TEFM基因shRNA真核表达载体的构建及其干扰效果鉴定

本研究旨在构建人TEFM基因的shRNA真核表达载体,对其抑制效率进行鉴定,以筛选出抑制效率最优的shRNA干扰载体.根据人TEFM基因全长cDNA序列(NM_024683.3),利用Ambion公司在线软件设计出4条shRNA,分别克隆至psi-U6载体中,得到4个重组干扰质粒TEFM-shRNA-1~TEFM-shRNA-4.重组子转化感受态细胞后挑取阳性克隆子进行PCR鉴定和DNA测序验证.将4个shRNA真核表达载体分别转染人脑胶质瘤U87细胞,使用嘌呤霉素筛选稳定转染细胞株后,通过qPCR和Western blotting分别检测各组细胞中TEFM的mRNA和蛋白质表达水平.PCR鉴定和DNA测序鉴定证实重组质粒中已插入目的DNA序列.qRT-PCR和Western blotting结果表明,4个重组载体均可以显著降低TEFM的mRNA和蛋白质表达水平(P<0.01),其中以TEFM-shRNA-3和TEFM-shRNA-4的抑制效率最优,对TEFM mRNA表达的抑制率分别为76.5%和78.8%,TEFM蛋白表达的抑制率分别为69.5%和74.8%.成功构建TEFM基因shRNA真核表达载体,转染人脑胶质瘤U87细胞并成功筛选出稳定沉默细胞株,为进一步探索TEFM在脑胶质瘤中的生物学功能和作用机制奠定了实验基础.

象草4CL基因片段的克隆及RNAi表达载体构建

象草是热带和亚热带地区广泛栽培的多年生资源植物。为探讨华南象草4-香豆酸:CoA连接酶(4CL)基因下调表达对木质素合成的影响,本研究设计1对特异引物,PCR扩增获得一段长为374bp的干扰片段。通过TO-PO克隆,将该片段克隆到载体pCR/GW/TOPO,构建了入门克隆载体pENTR-4CL;再经过LR反应使pE-NTR-4CL上的干扰片段进入目的载体pCB2004B上,形成表达载体pCB2004B-4CL,最后通过冻融法将其转入到根癌农杆菌EHA105中。菌液PCR结果表明RNAi质粒已成功转入农杆菌,为进一步利用RNAi技术研究4CL基因的功能奠定了基础。

葡萄病毒AMP基因RNA干扰载体的构建

RNA干扰(RNAi)介导的植物抗病毒研究是近年来引起广泛关注的一项植物抗病毒基因工程策略。以GVA运动蛋白(MP)基因为模板扩增出了418 bp的基因片段,根据RNA干扰的基本原理,将目的片段正反向分别插入到载体pFGC5941内含子的两侧以便其转录过程中高效产生RNA发夹结构。经PCR扩增证明已成功构建以GVA MP基因为靶标的干扰载体pFGC5941-GVAFR,并成功转入农杆菌EHA105中,为后续探讨干扰载体的干涉效果奠定了基础。

玉米淀粉分支酶SBEⅡb基因RNA干涉表达载体的构建和转化

应用聚合酶链式方应技术扩增玉米淀粉分支酶第20外显子155 bp的基因片段,并将其正向和反向克隆到pUCCRNA i载体上。利用pHMW.GUS与pCAMB IA1300作为桥梁载体,构建了含胚乳特异启动子和潮霉素筛选基因的RNA干涉表达载体pCAMB IA1300+HMW+2F。通过三亲杂交将pCAMB IA1300+HMW+2F表达载体转化到根癌农杆菌LBA4404,对玉米自交系178进行遗传转化,通过抗性筛选和PCR检测,获得了4株PCR阳性苗。

玉米FAD2基因RNA干涉表达载体的构建及转化

根据已克隆的ZmFAD2基因(GenBank登陆号:DQ496227)设计引物,通过RT-PCR扩增得到120 bp的特异性基因片段作为hpRNA干涉片段。利用pUCCRNA i与pUb i.cas为中间载体,成功构建了含Ub iqu itin启动子和hpRNA i片段的干涉表达载体p1 300+UFIFN。以自主选育的高油玉米自交系幼胚为材料,诱导、继代出胚性愈伤组织,利用携带p1 300+UFIFN质粒的根癌农杆菌LBA4404对其进行遗传转化。对抗性植株进行PCR检测,共获得6株转基因阳性株。

同源重组快速构建百合LCHS2基因RNAi表达载体及其鉴定

为探讨CHS基因的下调表达对花朵着色的影响以及为百合观赏性状遗传改良提供技术支持,利用基于同源重组原理的Gateway技术,根据课题组从东方百合‘索邦’分离的LCHS2基因序列(Genbank登录号:GQ483376)和pENTR/D-TOPO载体要求,设计上游5'端添加'CACC'的一对特异引物,PCR扩增获得636 bp的干扰片段。通过TOPO克隆,将该片段克隆入载体pENTR/D-TOPO构建入门克隆载体pENTR/D-CHS,测序结果显示,与原序列同源性为100%。再经过LR反应使pENTR/D-CHS上的干扰片段替换掉目标载体pHellsgate12上的ccdB片段,快速构建了包含LCHS2基因干扰片段的RNAi表达载体pH12-CHSi,经限制性内切酶XhoI、XbaI酶切鉴定获得724 bp和722 bp的片段,与预期结果一致。pH12-CHSi电击法转化农杆菌GV3101,菌液PCR鉴定,出现636 bp的目的条带,表明RNAi表达载体pH12-CHSi已成功转入农杆菌。

红麻6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6PDGH)基因克隆及RNAi载体构建

【目的】克隆红麻不育系和保持系6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6PDGH)基因,并构建其RNAi载体,为进一步研究其在红麻花药发育中的功能奠定基础。【方法】根据红麻花药转录组高通量测序数据结果和生物信息学方法获得6PDGH基因全长c DNA拼接序列,分别以红麻不育系(P3A)和保持系(P3B)的花药反转录c DNA及总DNA为模板克隆红麻6PGDH基因全长。依据RNAi载体设计原则,选取红麻6PGDH基因c DNA序列中段389 bp的特异片段做为RNA干扰片段,构建红麻6PGDH基因的RNAi载体。【结果】克隆获得的红麻不育系(P3A)和保持系(P3B)花药6PGDH基因全长均为1751 bp,均包含1458 bp的开放阅读框,编码485个氨基酸残基,无内含子;其碱基序列在不育系和保持系中仅存在两个碱基差异。该基因氨基酸序列(Gen Bank登录号KF964027)与拟南芥、玉米、大豆、苜蓿、三角叶杨、蓖麻的6PDGH同源性分别为75.07%、84.57%、86.50%、87.24%、91.19%和92.01%。成功构建了红麻6PGDH基因的RNAi载体,获得了干扰表达载体p ART27-p KANNIBAL-R1+2。【结论】成功克隆获得红麻6PGDH基因全长序列,构建的干扰表达载体可用于红麻6PGDH基因的功能研究。

大豆翻译起始因子4E 干扰片段克隆及其 RNAi载体构建

应用基于RNA干扰（ RNA interference，RNAi）原理的大豆转基因技术，能够在转录水平沉默同源靶基因，这为转基因抗病毒作物的培育提供了新的策略。通过比对已报道的能与病毒VPg发生互作的10种植物的eIF4E氨基酸序列，确定出大豆eIF4E的保守区间为62～237位氨基酸序列，克隆出406 bp的干扰片段eIF4Ei（含58 bp特异性重组序列attB），进而采用GATEWAY技术构建了干扰表达载体pB7GWIWG2（Ⅱ）-eIF4Ei。之后通过测序证实干扰片段eIF4Ei在载体构建过程中没有发生变异；酶切试验证实终端质粒的2个ccdB位点均被eIF4Ei置换；用启动子和终止子设计的引物对含有重组质粒的菌液进行PCR扩增，证实2个干扰片段以相反的方向插入到终端质粒中。从而证明反向重复的干扰表达载体构建成功，为应用基于RNAi原理的大豆转基因技术培育对大豆花叶病毒具有抗性的大豆新种质提供了基础材料。

外源RNA干涉基因在烟草中的转化及表达

依据RNA干涉机制,以TMV复制酶基因为靶标基因,针对TMV5个株系复制酶基因间高度同源序列设计引物,经RT-PCR反应获得靶序列,构建靶序列反向重复结构的RNA干涉双元载体。用根癌农杆菌介导将外源基因转化至烟草品种K326基因组中,培育RNA干涉转基因烟草。人工接种病毒验证转基因烟草中外源基因在植物抗病毒能力方面的表达效果,实时荧光定量PCR分析转基因烟草抗病毒能力。结果表明,实验培育的RNA干涉转基因烟草67%对TMV呈现高度抗性;荧光定量PCR分析显示,对TMV具高度抗性的转基因烟草中病毒复制酶基因转录产物mRNA存在很大程度的降解,证实了RNA干涉技术在培育抗病毒烟草品种中的效果。