反转录病毒载体转染小鼠骨髓细胞

背景:为方便、准确检测外源细胞在体内的存活情况,需在外源细胞转移标记基因。目的:观察多种细胞因子联合刺激下反转录病毒载体对BALB/C×C57BL F1代小鼠骨髓细胞基因转移效率的影响。方法:以PA317-GCGPXSN细胞制备病毒上清,NIH3T3细胞测定病毒滴度后,取经过干细胞因子、白细胞介素3、白细胞介素6预培养刺激后的BALB/C×C57BL F1代小鼠骨髓细胞,实验组实施基因转移,流式细胞仪及PCR方法测定基因转移效率。阴性对照组不做基因转移。阳性对照组为PA317-GCGPXSN细胞株。结果与结论:①病毒滴度为1.9×108CFU/L。②对照组 BALB/C×C57BL F1代小鼠骨髓细胞测定的荧光强度数值为0.63%,实验组为76.04%,两组相比差异有显著性意义(P<0.01)。PCR方法扩增到了NeoR基因的特异性片断,结果证实细胞因子预刺激后实施基因转移,可有效地将外源基因转移进入BALB/C×C57BL F1代小鼠骨髓细胞基因组中。

逆转录病毒介导GM-CSF在造血祖细胞中的基因转移

为了探索GM-CSF基因治疗的可行性,采用逆转录病毒载体介导的基因转移方法将小鼠GM-CSF cDNA逆转录病毒pLXSN/GM转染病毒包装细胞PA317,然后感染富含造血干、祖细胞群体,经含G418的体外半固体造血祖细胞培养,表现出较多的G418抗性CFU-GM生成,用PCR和Southem Blot方法分别检测出转化细胞基因组中整合有Neo^R基因和GM-CSF cDNA,原位杂交显示转化细胞有较强的GM-CSF mRNA表达,在Dexter培养中,GM-CSF修饰组的成熟非粘附细胞计数明显高于对照组(P<0.05).上述结果表明GM-CSF重组逆转录病毒成功地转入造血祖细胞并获得了表达,为下一步体内基因治疗奠定基础.

应用X线照射后的Balb/c小鼠制备白血病模型的方法学研究

目的:探索用SPF级Balb/c小鼠经X线照射后,尾静脉注射转染GFP及NeoR基因的K562细胞株以制备白血病模型的方法。方法:实验组小鼠分别经X线照射2Gy和3Gy,24小时后取对数生长期的K562(GFP+/Neo+)细胞尾静脉注射2×106个/只。对照组不予特殊处理。结果:实验组在接种5-7天时发病,分别于30、24天内全部死亡;生存天数显著短于对照组(P<0.01)。体重较对照组显著下降(P<0.05)。小鼠的白血病发病率为100%,无自发缓解。随照射剂量的增加,小鼠的存活时间缩短,且外周血及骨髓中白血病细胞所占比例增加。流式细胞仪测定及PCR方法也证实了GFP+细胞和NeoR基因在外周血、骨髓、肝、脾中的存在。结论:Balb/c小鼠经照射后从尾静脉注射K562细胞株可以获得白血病模型。

细胞因子对小鼠造血祖细胞基因转移效率的影响

目的：观察细胞因子对逆转录病毒载体介导的ＮｅｏＲ基因在小鼠造血祖细胞及人Ｋ５６２细胞中基因转移效率的影响，以探求最有效地促进造血细胞基因转移的细胞因子或其组合。方法：白细胞介素１α（ＩＬ－１α）、白细胞介素３（ＩＬ－３）、干细胞因子（ＳＣＦ）作用下预培养的骨髓细胞用含病毒颗粒的上清转染后，经Ｇ４１８或不含Ｇ４１８体外半固体培养，以生物学方法及ＰＣＲ方法检测造血祖细胞的某因转移效率。结果：ＩＬ－１α／ＩＬ－３／ＳＣＦ联合应用能最有效地提高小鼠ＣＦＵ－ＧＭ基因转移效率，使转移效率从（６．０４±１．３４）％提高到（４３．６±５．９４）％；ＳＣＦ单独应用能最有效地促进Ｋ５６２细胞基因转移，使其转移效率从（１９．０４±１．５８）％提高到（５４．４６±２．１３）％。结论：ＩＬ－１α／ＩＬ－３／ＳＣＦ联合应用可提高造血干、祖细胞基因转移效率，ＳＣＦ可用于急性髓性白血病患者自体骨髓移植时基因标志的临床研究。

波氏假丝酵母启动子的克隆及新霉素基因的表达

报道了波氏假丝酵母（Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ）启动子的克隆，将克隆的启动子与 Ｎｅｏ基因重组构建了 含Ｎｅｏｒ基因的表达载体ＹｅｐＮＰ１８１，转化波氏假丝酵母，实现了Ｎｅｏｒ基因在波氏假丝酵母中的表达，使波氏 假丝酵母转化子能在含Ｇ４１８的抗性培养基上生长从而建立了Ｎｅｏｒ基因──Ｇ４１８选择系统，为外源基因在 波氏假丝酵母中表达创造了条件．

逆转录病毒载体介导Neo^R基因转入正常人造血祖细胞

本文应用逆转录病毒载体介导基因转移法将含有新霉素抗性(neo^R)基因的双拷贝逆转录病毒载体pN2A转入正常人造血祖细胞。应用Ficoll分层液(比重1.064)富集人造血干、祖细胞,预培养后与已经照射的生产重组病毒包装细胞株共同培养24小时,经含G418(1000μg/ml)体外半固体培养,可见具有抗性的CFU-GM集落生长。应用PCR方法检测转染细胞中neo^R基因的转移和表达,在生产逆转录病毒的辅助细胞株PA317/N2及体外液体培养的骨髓细胞中均可扩增出neo^R基因的DNA片段,进一步证实了neo^R基因在正常人造血干、祖细胞的有效转移和表达。

Effect of cytokines on the efficiency of gene transfer into murinehematopoietic progenitors

The purpose of this study was to evaluate the effect of cytokines on the efficiency of gene transfer into murine hematopoietic progenitors and human K562 cells mediated by retrovirus vectors (RV) containing bacterial neomycin-resistant (neoR) gene. The bone marrow cells were preincubated with cytokines and then transfected with supernatant containing retrovirus vectors, each for 24 h. The transfected cells were plated in the semisolid culture with or without G418. The efficiency of gene transfer into hematopoietic progenitors was estimated by biological assay and PCR analysis. The most efficient combination of the cytokines, IL-1α/IL-3/SCF,increased the efficiency of gene transfer into murine CFUGM from 6.04±1. 34% to 43. 60±5. 94%. SCF alone most efficiently facilitated the gene transfer into K562 cells from 19.04±1. 58% to 54.46±2. 13%. The results suggest that the combination of IL-1α/IL-3/SCF can increase efficiency of gene transfer into hematopoietic stem cells (HSC) and progenitors, and in the treatment of acute myeloid leukemia (AML) using autologous bone marrow transplantion (ABMT),SCF can facilitate gene transfer into hematopoietic cells in gene-marking clinical studies.

癌的基因疗法进展(综合报道)

过去10年,由于对癌免疫防御的分子生物学认识的不断增加,以及重组DNA技术的进展,使得应用逆病毒的转导基因技术治疗人类疾病成为现实.方法[肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的生长]将新鲜的肿瘤标本切成3～5mm^3小块,放入含有Ⅳ型胶原酶、Ⅴ型透明质酸酶和Ⅳ型脱氧核糖核酸酶的培养液中消化.次日,将单细胞悬液过滤、洗涤。