金钱鱼毒腺基因NeoVTX的基因序列和表达

为了解金钱鱼毒液成分,从其基因组中分离了NeoVTX⁃α和NeoVTX⁃β基因序列,进行生物信息学分析,并研究它们在毒腺及其他组织的表达特征。结果表明,金钱鱼NeoVTX⁃α和NeoVTX⁃β的开放阅读框ORF全长分别为1581 bp和2106 bp,分别编码526和701个氨基酸。同源性和系统进化分析发现,金钱鱼NeoVTX⁃α与鲉形目的荫平鲉、尖头拟鲉、玫瑰毒鲉、粗毒鲉等鱼类同属一支且同源性较高(67.3%~73.5%)。金钱鱼NeoVTX(α和β亚基)三维结构与粗毒鲉的SNTX(α和β亚基)毒素的三维结构比较相似。qPCR和转录组数据表明,金钱鱼NeoVTX⁃α和NeoVTX⁃β在毒腺组织中高表达,其他组织低表达或不表达。研究表明,NeoVTX可能是金钱鱼中一种与鲉形目毒素相类似的毒素。

中国南海石头鱼毒素NeoVTX的分离纯化、基因克隆及表达

目的:分离并鉴定石头鱼粗毒液毒性成分,克隆其序列并进行原核表达。方法:利用SDS-PAGE及凝胶过滤HPLC分离石头鱼粗毒液,质谱鉴定其序列;利用RACE技术钓取毒素基因;将获得的毒素cDNA连入pET-22b(+)载体,转化宿主细胞大肠杆菌,经IPTG诱导表达,用亲和层析纯化目的蛋白。结果:从石头鱼粗毒液中分离到NeoVTX等多种蛋白质,克隆了NeoVTXα和β亚基的cDNA序列,获得了纯度为95%以上的重组α亚基蛋白。结论:中国南海石头鱼粗毒液的主要成分为NeoVTX,其α、β亚基序列与日本冲绳海域石头鱼NeoVTX的α和β亚基具有很高的同源性;大肠杆菌菌株可稳定表达α亚基。该工作为NeoVTX抗体制备奠定了基础。

双抗体夹心ELISA法检测石头鱼毒素

目的建立石头鱼毒素neoVTX的酶联免疫吸附试验(ELISA)检测方法,为该毒素的检测、中毒诊断及治疗提供依据。方法以过碘酸钠法偶联马抗-HRP,利用双抗体夹心ELISA方法检测neoVTX。结果该法的线性范围在磷酸盐缓冲液(PBS)中为4~512 ng/ml,线性回归方程为Y=1.676X-1.140(r^2=0.9728,n=8,P<0.0001),在血浆中检测线性范围为4~2048 ng/ml,线性回归方程为Y=0.3094X-0.1208(r^2=0.9907,n=10,P<0.0001)。牛血清白蛋白、卵清蛋白及人血浆对检测结果无干扰。结论成功建立了石头鱼毒素的双抗体夹心ELISA检测方法,该法有较高的灵敏度和特异性,适用于溶液中及血浆中微量neoVTX的样品分析。

石头鱼毒素胶体金检测试纸条的研制

目的研制石头鱼毒素(neoverrucotoxin,stonefish toxin,neoVTX)的胶体金检测试纸条,建立一种该毒素的快速检测方法。方法采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液,以neoVTX马血清抗体用于胶体金标记,并将该抗体固定于硝酸纤维素膜作为捕获抗体,利用双抗体夹心法原理制备胶体金检测试纸条。结果制备的检测试纸条对该毒素检测灵敏度为50 ng/ml,该试纸与牛血清白蛋白、卵清蛋白及水母毒素等蛋白无反应,具有较好的特异性。结论成功研制了石头鱼毒素胶体金检测试纸,该试纸条灵敏度高,特异性好,可用于该毒素的快速检测。

新玫瑰毒鲉毒素马血清抗体制备及抗毒活性研究

目的建立毒鲉毒素(俗称石头鱼毒素)马血清抗体的制备方法并研究其抗毒活性,为毒鲉毒素中毒提供治疗手段。方法利用排阻色谱制备毒鲉毒素,免疫马匹制备毒鲉毒素马抗,再制备不含FC的F(ab’)2并研究其对小鼠的抗毒活性。结果制备了新玫瑰毒鲉毒素(neoVTX)322.6 mg,纯度为88%,制备的马血清抗体原液中的蛋白含量为41 g/L,F(ab’)2的含量为87.05%,IgG含量为1.35%。4 LD50毒鲉粗毒素可被2倍质量的马抗完全中和;3 LD50neoVTX可被3倍质量的马抗完全中和。结论成功制备了毒鲉毒素及其马血清抗体,该抗体具有较高的抗毒活性,为毒鲉毒素中毒提供了治疗手段。