用重组蛋白NcSAG1t作为ELISA诊断抗原进行改良绒山羊Neospora caninum的血清学诊断

Ncaninum的表面抗原1(NcSAG1)在建立新孢子虫病的诊断上是一个重要的诊断抗原。为了建立有效的诊断方法,基因编码的截头(NcSAG1t)缺失一个信使缩氨酸和C-末端的疏水性区域的基因,象谷胱甘肽转移酶(GST)的融合蛋白一样被克隆和表达在escherichiacoli。纯化的GST-NcSAG1t作为ELISA诊断抗原被用在改良绒山羊N caninum抗体的检测中。经过对207份改良绒山羊血清样品进行检测,检出Ncaninum抗体阳性16份,阳性率为7.73%。结果初步说明青海省的改良绒山羊羊群中存在Ncaninum。

Histopathological and molecular study of Neospora caninum infection in bovine aborted fetuses

Objective:To estimate the extent to which abortion in dairy cows was associated with of Neospom caninum(N.caninum) and to determine the risk factors of neosporosis in dairy farms from 9 provinces in Iran.Methods:Polymerase chain reaction(PCR) test was used to detect Neospora infection in the brain of 395 bovine aborted fetuses from 9 provinces of Iran.In addition,the brains of aborted fetuses were taken for histopathological examination.To identify the risk factors associated with neosporosis,data analysis was performed by SAS.Results:N.caninum was detected in 179(45%) out of 395 fetal brain samples of bovine aborted fetuses using PCR.Among the PCR-positive brain samples,only 56 samples were suited for histopathological examination.The characteristic lesions of Neospora infection including non-suppurative encephalitis were found in 16(28%) of PCR-positive samples.The risk factors including season,parity of dam,history of bovine virus diarrhea and infectious bovine rhinotracheitis infection in herd,cow's milk production,herd size and fetal appearance did not show association with the infection.This study showed that Neospora caused abortion was significantly more in the second trimester of pregnancy than other periods.In addition,a significant association was observed between Neospora infection and stillbirth.Conclusions:The results showed N.caninum infection was detected in high percentage of aborted fetuses.In addition,at least one fourth of abortions caused by Neospora infection.These results indicate increasing number of abortions associated with the protozoa more than reported before in Iran.

Prevalence of Antibodies to <i>Toxoplasma gondii</i>and <i>Neospora caninum</i>in Pigs in Grenada, West Indies

The aim of the study was to estimate the prevalence of antibodies to Toxoplasma gondii (T. gondii) and Neospora caninum (N. caninum) in pigs in Grenada, West Indies. T. gondii is a serious zoonosis affecting the unborn fetus and immunocompromized individuals. N. caninum is a similar coccidian parasite, which is not zoonotic, but is the cause of abortion and neonatal mortality in livestock similar to T. gondii. An earlier study conducted in Grenada and using a modified agglutination test (MAT) revealed seropositivity to T. gondii in pigs. No information is available on N. caninum infection of pigs in the Caribbean islands including Grenada. Serum samples from 185 pigs in Grenada, West Indies were tested for antibodies to T. gondii and N. caninum using an indirect enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). Antibodies to T. gondii were found in 24.3% of pigs (95% confidence interval (CI): 18.12% to 30.48%) as all the tested pigs were negative for antibodies to N. caninum. Although, seroprevalence for T. gondii was higher in females (25.75%) than in males (20.70%), this result was statistically insignificant (p = 0.57). The results were similar to a previous study in Grenada confirming the continuity of infection in pigs. Human Toxoplasmosis is transmitted mainly through ingestion of tissue cysts in contaminated raw or undercooked meat or sporulated oocysts in soil, water or vegetables. Education of farmers and the Grenadian community on epidemiology of these parasites is warranted to prevent infection in pigs and in humans. This is the first report on the seroprevalence of N. caninum in pigs in the Caribbean region.

Neospora caninum immune mapped protein 1(NcIMP1) is a novel vaccine candidate against neosporosis

The Neospora caninum immune mapped protein 1(Nc IMP1) was identified as a membrane protein,and a previous study indicated that Nc IMP1 could be a promising vaccine candidate against neosporosis. In this study, the immune response and protection efficacy of Nc IMP1 were evaluated. The coding sequence of Nc IMP1 was inserted into the eukaryotic expression vector pc DNA3.1(+), resulting in the recombination plasmid pc DNAIMP1, which was used for the intramuscular immunization of BALB/c mice. After immunization, the immune response was evaluated using a lymphoproliferative assay and cytokine and antibody measurements. Quantification of the cerebral parasite burden of mice challenged with 2106 N. caninum was performed 14 days after the last immunization. The results showed that the mice immunized with pc DNA-IMP1 developed a high level of specific antibody responses against recombinant Nc IMP1,with a mixed Ig G1/Ig G2 a response and a predominance of Ig G2 a production. The cellular immune response was associated with the production of IFN-γ, IL-2, IL-4 and IL-10 cytokines. The experiment was terminated 30 days p.i.,and the cerebral parasite burden in each mouse was assessed by quantitative PCR. The parasite burden was significantly reduced in the pc DNA-IMP1-vaccinated mice. These data suggest that IMP1 is a promising vaccine candidate against neosporosis.

Protective efficacy of vaccination with NcMIC3 and NcMIC8 against Neospora caninum infection in mice

Microneme proteins (MICs) are important for Apicomplexan parasite invasion due to their adhesion to host cells. Several studies have indicated that Neospora caninum MIC3 and MIC8 are important adhesion factors and potential vaccine candidates against neosporosis. In this study, we evaluated the protective efficacy of recombinant proteins and DNA vaccines of NcMIC3 and NcMIC8. BALB/c mice were immunized with rNcMIC3, rNcMIC8, pcDNA3.1-NcMIC3 and pcDNA3.1-NcMIC8 respectively, and challenged with N. caninum tachyzoites. The immune responses were evaluated through cytokine, antibody measurements and the parasite burden in the mice brain tissues. Serological analysis showed that recombinant protein vaccines induced higher levels of immunoglobulin G (IgG) than other groups. The percentage of IgGl and IgG2a in the recombinant protein groups was higher than the other groups, and with a predominance of IgGl over IgG2a, suggesting that recombinant protein vaccines elicited a Th2-type immune response, while DNA vaccines mainly produce a Th 1-type immune response. In addition, mice immunized with rNcMIC3 and rNcMIC8 a had lower parasite burden in brain tissue compared with the other groups. These results demonstrate that rNcMIC3 and rNcMIC8 could induce humoral and Th2-type immune response, leading to a considerable level of resistance against neosporosis.

河南孟津地区6种引起奶牛流产病原的PCR检测及分析

为调查孟津地区引起奶牛流产的主要病原,本实验采集该地区8个规模化奶牛养殖场共52头新鲜流产胎牛,及其母体的血液、阴道分泌物和鼻腔分泌物。对所采集样本进行新孢子虫(%N.caninum)、弓形虫(T.gondii)、胎儿三毛滴虫(T.foetus)、布氏杆菌(B.abortus%)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)6种常见流产病原的PCR和RT-PCR检测。结果显示,被检样本总感染率为44.2%(23/52),其中新孢子虫感染率最高,为32.7%(17/52);IBRV次之,为13.5%(7/52);胎儿三毛滴虫、布氏杆菌、弓形虫和BVDV感染率分别为1.9%、1.9%、1.9%和0。11.5%(6/52)的被检样本存在混合感染,其中以新孢子虫+IBRV混合感染为主(50%,3/6)。结合被检流产奶牛的临床特征及饲养管理等因素,推断新孢子虫是导致该地区奶牛流产的主要病原。

利用酵母双杂交技术筛选与新孢子虫NcSRS2蛋白相互作用的宿主蛋白

【目的】筛选与鉴定与新孢子虫NcSRS2蛋白相互作用的Vero细胞蛋白。【方法】从Nc1株犬新孢子虫速殖子中提取DNA作为模板,PCR扩增NcSRS2基因,克隆于pGBKT7表达载体,构建诱饵载体pGBKT7-NcSRS2,转化入Y2H酵母感受态细胞,进行自激活活性验证和细胞毒性检测。利用酵母双杂交技术,以转化诱饵载体pGBKT7-NcSRS2的Y2H酵母菌株与Vero细胞cDNA文库进行酵母双杂交,筛选与NcSRS2蛋白相互作用的宿主蛋白,对阳性克隆进行测序,并用BLAST分析,筛选出与NcSRS2存在相互作用的Vero细胞蛋白质。【结果】诱饵载体pGBKT7-NcSRS2无自激活活性和细胞毒性,可用于文库筛选。运用酵母双杂交系统,筛选出2个与NcSRS2相互作用的Vero细胞成分,分别是NADH dehydrogenase subunit 1和STMN2。【结论】本研究首次运用酵母双杂交技术筛选出与新孢子虫NcSRS2相互作用的Vero细胞蛋白质,为进一步研究犬新孢子虫NcSRS2参与黏附及入侵宿主细胞的机制奠定基础。

实时监控新孢子虫环介导等温扩增方法的建立及初步应用

为建立一种快速检测新孢子虫的环介导等温扩增方法(LAMP),本研究根据GenBank中登录的新孢子虫Nc-5基因序列(X84238.1)设计2对特异性引物,通过PCR扩增将新孢子虫Nc-5基因片段并克隆至pMD18-T载体中,构建重组质粒pMD18-T-Nc-5,并经PCR和测序鉴定正确后作为质粒标准品。通过优化该方法的引物浓度、反应温度,并利用LAMP浊度仪测定扩增目的基因时出现白色焦磷酸镁的浊度值实时监控反应进程,初步建立了检测新孢子虫的LAMP方法,反应结束后通过加入SYBR Green I观察荧光对结果可视化判定。反应条件优化结果显示,引物F3/B3和FIP/BIP的终浓度分别为10 pmol/μL、20 pmol/μL,63℃扩增40 min效率最佳。利用该方法检测新孢子虫、弓形虫、瑟氏泰勒虫、环形泰勒虫、双芽巴贝斯虫、伊氏锥虫核酸,并在反应结束后加入SYBR Green I观察荧光以评估该方法的特异性。结果显示仅新孢子虫核酸扩增为阳性,其余病原核酸均为阴性结果。荧光观察结果显示,新孢子虫反应管呈翠绿色荧光(阳性),其他反应管呈橙黄色荧光(阴性);对重组质粒标准品10倍倍比稀释后作为模板(即4.0×10^(7)拷贝/μL~4.0×100拷贝/μL)进行LAMP的敏感性试验,结果显示该方法对质粒标准品的检测限为4.0×10^(1)拷贝/μL,且在反应结束后加入SYBR Green I,4.0×10^(7)拷贝/μL~4.0×10^(1)拷贝/μL质粒标准品的反应管均呈翠绿色荧光(阳性),4.0×100拷贝/μL反应管呈橙黄色荧光(阴性),敏感性与《新孢子虫病检疫技术规范》(SN/T 3499)中荧光定量PCR方法的敏感性一致;分别以同一时间和不同时间提取的3个不同稀释度的质粒标准品进行批内和批间重复性试验,结果显示批内和批间重复性试验的变异系数均小于5%。综上表明该方法特异性强、敏感性高、重复性好。对895份临床疑似感染新孢子虫的动物肝脏、脑组织样品同时采用建立的LAMP方法及《新孢子虫病检疫技术规范》(SN/T 3499)中的荧光定量PCR方法检测,结果显示LAMP的阳性检测率为41.45%(371/895),阴性率为58.55%(524/895),与SN/T 3499中的荧光定量PCR检测结果一致。本研究建立的新孢子虫LAMP方法快速、敏感、特异性强,且能够实时监测反应过程并能可视化判定结果,为新孢子虫现场快速检测提供了新的技术手段。

牛支原体脂质相关膜蛋白GLCP抑制宿主EBL细胞凋亡的分子机制研究

为探究牛支原体(M.bovis)脂质相关膜蛋白(LAMPs)抑制宿主细胞凋亡的分子机制,本研究利用实验室前期经AKTA分子筛分成5组的M.bovis TJ株LAMPs分别刺激胎牛肺(EBL)细胞,经western blot检测各组LAMPs对EBL细胞中凋亡执行分子Caspase-3剪切激活水平的影响,经CCK-8试验检测筛选出的目标LAMPs对EBL细胞活力的影响,并对其进行蛋白质谱测序分析。结果显示,D组LAMPs能够抑制Caspase-3的剪切激活水平,并可以极显著提高EBL细胞活力,结合蛋白质谱测序结果以及生物信息学软件预测蛋白功能,选定VSPHB0801-4、TPP、DJ-1、EF-TU、GAPDH以及GLCP为候选蛋白进行后续试验。经PCR扩增dj-1基因,重叠延伸PCR扩增ef-tu和glcp融合基因,vsphb0801-4、tpp和gapdh基因片段则由华大基因公司合成,将上述基因片段分别克隆至相应的原核表达载体中,构建重组质粒pET-28a-vsphb0801-4、pET-28a-tpp、pET-32a-dj-1、pET-32a-ef-tu、pEGX-6P-1-gapdh和pMAL-c5X-glcp,并分别转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后通过亲和层析纯化目的蛋白,SDS-PAGE检测重组蛋白的纯化效果。结果显示,获得了纯度较高的6个重组蛋白。将不同浓度的6个重组蛋白分别刺激EBL细胞,经western blot验证重组蛋白是否具有抑制EBL细胞凋亡的作用,结果显示,只有重组蛋白GLCP能够抑制EBL细胞凋亡。因此,将其作为靶标蛋白进一步探究其抑制EBL细胞凋亡的分子机制。将不同浓度的重组蛋白GLCP分别刺激EBL细胞后,经western blot检测经典凋亡通路介导分子Caspase-8、Caspase-9和Caspase-12的剪切激活水平、激光共聚焦显微镜检测EBL细胞线粒体膜电位,以及western blot检测线粒体介导的凋亡通路关键分子Bcl-2、Bax、Cyt C、Apaf-1以及剪切的多聚ADP核糖聚合酶-1(PARP1)蛋白的表达水平。结果显示,重组蛋白GLCP主要抑制Caspase-9的剪切激活水平,提高线粒体膜电位,并上调线粒体介导的凋亡通路关键分子Bcl-2蛋白的表达水平,以及下调Bax、Cyt C、Apaf-1和剪切的PARP1蛋白表达水平。以上实验结果表明,重组蛋白GLCP主要通过线粒体介导的凋亡通路抑制EBL细胞凋亡。本研究首次筛选到抑制EBL细胞凋亡的M.bovis脂质相关膜蛋白GLCP,并初步解析了其抑制宿主细胞凋亡的分子机制,为M.bovis持续性感染机制的研究提供参考依据。

抗弓形虫和新孢子虫药物体外筛选方法的研究进展

弓形虫和新孢子虫是2种在形态结构及生物学特征方面非常相似的细胞内寄生性原虫,二者引起的疾病对人和动物健康造成了严重危害。开发和筛选高效、低毒的抗弓形虫和新孢子虫药物一直是抗原虫药物研究领域的重要方向之一。药物筛选包括体外筛选和体内筛选,体外筛选的结果是进行体内筛选的依据和基础。对抗弓形虫和新孢子虫药物的体外筛选方法研究进展进行综述,以期为开发更加高效的抗弓形虫和新孢子虫药物体外筛选技术提供参考。

犬新孢子虫Nc-1株在MDBK、Vero和MDCK细胞中的培养比较

为了分析新孢子虫在3种不同宿主细胞内的生长情况,该试验采用犬新孢子虫Nc-1株,将其与牛肾细胞(MDBK)、非洲绿猴肾细胞(Vero)和犬肾上皮细胞(MDCK)在37℃条件下培养10 d,每天观察比较3种细胞在虫体入侵前后的形态变化并记录虫体数量,绘制虫体生长曲线。结果表明:犬新孢子虫Nc-1株在MDBK、Vero和MDCK细胞中均能够正常生长。其中,Nc-1株在入侵Vero细胞的第6天可以较快达到生长高峰期,而在MDBK和MDCK细胞中生长较慢,在第7天才能达到虫体数量的最大值,且MDCK细胞中虫体数量最少。因此,除Vero细胞外,MDBK细胞也可作为一种培养新孢子虫良好的细胞系。该试验为深入了解新孢子虫感染机制和选择合适的体外培养模型提供重要参考。

福建省部分地区奶牛新孢子虫病血清学抗体检测

新孢子虫是造成怀孕母牛流产等繁殖障碍和新生犊牛运动障碍的重要寄生虫之一,目前尚未有有效的药物和疫苗来治疗和预防牛新孢子虫病。本研究使用新孢子虫抗体检测试剂盒对采自福建省漳州、南平、三明和龙岩4个地区规模化奶牛场的1472份奶牛血清样品进行抗体检测,并通过SPSS 22.0软件进行生物统计学分析。结果表明,血清样品新孢子虫抗体总阳性率为7.47%,4个地区样品阳性率分别为5.57%、5.12%、7.41%和12.97%;不同年龄阶段奶牛阳性率范围为2.93%~9.56%,不同胎次阳性率范围为4.83%~9.50%。经统计学分析,不同年龄阶段奶牛阳性率差异显著(P<0.05)。这表明福建省奶牛普遍存在新孢子虫感染,奶牛场应采取综合防控策略和制定有效的管理措施控制奶牛新孢子虫病。

奶牛犬新孢子虫流产诊疗防

新孢子虫病是由犬新孢子虫(Neospora caninum)引起的一种世界范围内流行的多种动物共患原虫病,给畜牧业造成了严重的经济损失,并潜在威胁人类健康。鉴于国内大部分奶牛场对犬新孢子虫感染危害认识不足或根本无知,本文以某规模化奶牛场发生的犬新孢子虫病为例,简述奶牛犬新孢子虫病的临床症状、诊断和预防措施,为奶牛犬新孢子虫流产诊疗防提供参考。

新疆地区流产奶牛新孢子虫病和布氏杆菌病的流行病学调查

为了调查我国新疆地区流产奶牛新孢子虫病和布氏杆菌病的感染情况，应用酶联免疫吸附试验（ELISA），对新疆15个地区419份奶牛血清样本（有流产史奶牛）进行了牛新孢子虫病和布氏杆菌病的检测。结果显示新疆地区流产奶牛新孢子虫感染率为10．3％，布氏杆菌病抗体阳性率为2．7％，同时检测到既有新孢子虫抗体又有布氏杆菌抗体的奶牛血清，占总数的0．95％，各牛场所检流产奶牛血清新孢子虫抗体阳性率在0—50％，各个年龄段奶牛血清的抗体阳性率差异不显著（P〉0．05）。不同妊娠胎次的奶牛血清抗体阳性率差异显著（P〈0．05）。调查结果表明，新疆部分地区奶牛存在新孢子虫的感染且是导致流产的重要原因之一。此次调查研究为今后新疆地区有效预防和治疗新孢子虫病提供了一定的科学依据。

奶牛新孢子虫重组蛋白NcSRS2t间接ELISA方法的建立及初步应用

以纯化的犬新孢子虫(Neospora caninum)重组蛋白NcSRS2t为抗原包被酶标板,通过对间接ELISA各反应条件的优化,确定了最佳反应条件。采用已建立的间接ELISA反应条件,对218份阴性血清的检测结果进行统计学分析,确定了间接ELISA的判定标准,即OD450nm值大于等于0.32为阳性,小于0.32为阴性。应用建立的间接ELISA方法对128份阴性血清和50份阳性血清(经IDEXX公司新孢子虫抗体检测试剂盒证实)进行检测,结果表明,间接ELISA方法的特异性为93.0%,敏感性为90.0%。采用本试验建立的新孢子虫间接ELISA诊断方法对黑龙江省克山、海林、双城、甘南、克东、富裕、牡丹江、大庆等8个县(市)奶牛场的540份奶牛血清进行了检测。结果表明,被检的540份奶牛血清样本中奶牛新孢子虫的抗体阳性率为13.33%。该间接ELISA诊断方法的建立及初步应用为新孢子虫病诊断试剂盒的研制和新孢子虫病的预防研究奠定了基础。

牛新孢子虫病和弓形虫病的流行病学调查

为了调查我国牛新孢子虫和弓形虫的感染情况，应用新孢子虫酶联免疫吸附试验（ELISA）和弓形虫间接血凝试验（IAT）分别检测了来自国内10个省（市、自治区）的262份乳牛、10份肉牛和40份水牛血清。结果显示，乳牛新孢子虫的抗体阳性率为17．2％，弓形虫的抗体阳性率为2．3％，没有检测到既有新抱子虫抗体又有弓形虫抗体的乳牛血清。各牛场所检乳牛血清的新孢子虫抗体阳性率在0～34．4％之间。在水牛和肉牛血清中未检测到新孢子虫抗体和弓形虫抗体。流产乳牛血清的新孢子虫抗体阳性率为20．2％，未流产乳牛为16．1％，其中血清抗体阳性乳牛主要在妊娠中晚期流产。各个年龄段乳牛血清的抗体阳性率差异不显著（P〉0．05）。不同妊娠胎次的乳牛血清抗体阳性率差异不显著（P〉0．05）。确认新孢子虫病在国内大部分牛场存在。

牛新孢子虫病PCR检测方法的建立和应用

犬新孢子虫感染是导致妊娠母牛流产的主要原因之一,准确快速地诊断是有目的治疗该病的前提。本研究根据已知的犬新孢子虫种属特异性基因片段Nc-5基因序列,设计了一对特异性引物,建立了检测犬新孢子虫的PCR技术。利用本方法可以从感染牛胎儿的脑脊液及实质脏器中扩增出1条大小为350 bp的特异性核酸片段。在吉林省延边龙井地区的应用检测结果表明,流产牛胎儿中新孢子虫感染率为17%(15/90)。本方法在实际应用中快速、灵敏、特异性高,可以用于牛和其它动物新孢子虫病的快速诊断和流行病学调查。

新孢子虫dNcSRS2重组蛋白间接ELISA的建立及其应用

利用新孢子虫体外重组表面蛋白dNcSRS2蛋白作为包被抗原,对各项条件进行优化,确定判定标准,建立了检测新孢子虫血清抗体的间接ELISA方法。经对多例血清检测表明,所建立的诊断试剂盒重复性好、特异性强、灵敏度高,与进口的IFAT及两种商品化ELISA试剂盒的检测结果相比较,符合率均达到92%以上。应用建立的ELISA方法对236份奶牛血清的新孢子虫抗体进行检测,阳性率为22%。这是国内首次利用重组蛋白建立的诊断试剂盒,该方法的建立将为牛新孢子虫病的诊断与流行病学调查提供有效的技术手段。

乳牛流产胎儿中新孢子虫的鉴定

在血清学调查的基础上,进行了流产胎牛体内新孢子虫的鉴定。取新孢子虫血清抗体阳性乳牛的流产胎牛的脑、心、肺、脾、肝等组织进行病理学检查,经HE染色观察到脑组织中存在类似于新孢子虫包囊样结构,经免疫组织化学染色排除刚地弓形虫包囊的存在,确认该包囊为新孢子虫包囊。同时提取流产胎牛脑组织DNA,应用新孢子虫特异性引物Np6/Np21进行PCR扩增,扩增出的特异性目的条带的序列与新孢子虫标准株Nc-1的gene 5序列的一致性为98%。首次证实我国大陆流产胎牛脑组织中存在新孢子虫。

吉林株犬新孢子虫的分离与鉴定

将疑似感染犬新孢子虫而流产的牛胎儿脑组织接种于Vero细胞进行体外培养,同时感染长爪沙鼠进行动物试验。提取牛流产胎儿脑组织DNA、沙鼠脑组织DNA、细胞培养虫体DNA,用犬新孢子虫特异性引物进行PCR扩增。结果显示,PCR扩增出了1条约为681 bp的目的条带;测序结果表明,扩增出的特异性目的基因序列与GenBank中发表的犬新孢子虫NcSAG1基因(AF113004)核苷酸序列的同源性为99.4%。结果表明,在吉林省牛流产胎儿脑组织中分离出犬新孢子虫。