R262K点突变将紫穗槐二烯合酶变为(3R)-(E)-nerolidol合酶

倍半萜合酶家族催化单一底物法尼基焦磷酸形成近300多种链式、单环、双环和三环倍半萜烯、醇,进一步的加工修饰产生种类更加繁多的倍半萜衍生物。详细了解倍半萜合酶产物特异性性决定机制将会为倍半萜合酶的理性设计,定向生成新型化合物打下基础。本研究利用定点突变技术,对紫穗槐二烯合酶RxR基序及相关的D300位点进行了点突变,发现保守基序中R262K单点突变后其酶促反应主产物为(3R)-(E)-nerolidol,而R262L突变使酶失去活性,R264K突变则对产物比例无影响,显示保守基序中第一个精氨酸在活性中心疏水环境的维持中非常关键。D300突变结果显示此氨基酸对酶的活性维持非常必要,结合R262突变结果,推测R262和D300间的非键相互作用对酶活性的维持起重要作用。由于RxR基序在倍半萜合酶家族中非常保守,因此其作用是否具有普遍性值得进一步验证。

茶树橙花叔醇和芳樟醇樱草糖苷含量全基因组关联分析及候选基因预测

橙花叔醇与芳樟醇是广泛分布于植物中的挥发性萜烯醇类化合物,在茶树新梢中主要以樱草糖苷形式存在,提高其含量对茶叶香气品质改良具有重要意义。为揭示茶树橙花叔醇和芳樟醇樱草糖苷的遗传机制,本研究以169个茶树自然杂交后代单株为关联群体,利用均匀分布在茶树染色体上的675,245个SNP标记,对3个年份下茶树新梢中橙花叔醇与芳樟醇樱草糖苷含量进行全基因组关联分析(genome-wide association study,GWAS)。结果表明,橙花叔醇与芳樟醇樱草糖苷含量的表型变异系数为60.83%~80.08%,广义遗传力分别为51.29%与61.87%,基本符合正态分布,具有典型的数量性状遗传特征。全基因组关联分析共检测到50个显著关联位点,各位点分别对橙花叔醇和芳樟醇樱草糖苷含量变化的贡献率均超过20%,其中橙花叔醇樱草糖苷含量(nerolidol primeveroside content,NPC)变化位点最大贡献率为38.73%,芳樟醇樱草糖苷含量(linalool primeveroside content,LPC)变化位点最大贡献率为39.07%。通过等位变异效应分析,鉴定出4个主效SNP位点及其优异等位变异,并发现1个可同时调控NPC和LPC的一因多效位点。结合已有的文献报道和基因的功能注释,筛选出每个显著位点置信区间内最有可能的候选基因共59个,主要涉及茶树的糖类代谢、转录调控、萜烯类生物合成等多个生物学过程,其中26个基因在适制绿茶品种和适制乌龙茶品种单芽中的表达水平存在显著差异。本研究为深入解析茶树橙花叔醇和芳樟醇樱草糖苷含量的遗传机制提供了新的信息,为加速培育高香型优异茶树新品种提供了重要的基因资源。

香樟和银杏落叶海水浸提液对东海原甲藻的抑藻效应及其有效成分分析

为寻找防治赤潮的有效手段,以香樟(Cinnamomum camphora)和银杏(Ginkgo biloba)落叶作为抑藻制剂材料,探究其常温海水浸提液对东海赤潮高发区原因种东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)的化感抑制效果,并分别采用顶空-固相微萃取-气相色谱/质谱联用法和超高效液相色谱串联四极杆-飞行时间质谱法分析了香樟和银杏海水浸提液中的有效成分。结果表明:香樟和银杏叶浸提液对东海原甲藻生长的96 h半效应浓度(96 h-EC50)分别为1.23 g·L^(-1)和1.22 g·L^(-1)。高浓度香樟叶浸提液(≥3.0 g·L^(-1))处理72 h时即可使大量东海原甲藻细胞破裂,96 h时对东海原甲藻生长的抑制率高于70%,且在第8天仍可抑制东海原甲藻的生长。银杏叶浸提液对东海原甲藻的抑制作用起效快,处理24 h时,高浓度试验组(≥3.0 g·L^(-1))中东海原甲藻基本失去游动能力,处理96 h时,浓度≥2.0 g·L^(-1)的银杏叶浸提液对东海原甲藻生长的抑制率均达到了80%以上。另外,从香樟叶浸提液中共分离鉴定出了芳樟醇、橙花叔醇、桉油烯醇和桉叶油醇等可能具有化感作用的萜类物质,从银杏叶浸提液中分离鉴定出了儿茶素、芦丁和槲皮素等可能具有化感作用的黄酮类物质,其中橙花叔醇对东海原甲藻的生长具有明显抑制作用。橙花叔醇对东海原甲藻生长的96 h-EC50为1.25 mg·L^(-1);24 h时,4.0 mg·L^(-1)橙花叔醇即可使大量藻死亡,并使藻细胞丧失游动性;96 h时4.0 mg·L^(-1)橙花叔醇对东海原甲藻的抑制率达到了99.55%,所以橙花叔醇是一种有潜力的抑藻活性成分。研究结果为进一步探讨陆生植物对藻类的化感作用机理及制备复方抑藻剂提供了一定的科学参考。

橙花叔醇通过Wnt-β-catenin通路调控黑色素瘤细胞的恶性生物学行为

目的:探讨橙花叔醇通过Wnt-β-catenin通路抑制黑色素瘤A-375和WM-115细胞恶性生物学行为的分子机制。方法:体外培养黑色素瘤细胞A-375和WM-115,用不同浓度的橙花叔醇处理,采用SRB法和克隆形成实验、FCM术、Transwell实验和细胞划痕实验、DCFH-DA染色法、qPCR和WB法分别检测橙花叔醇对A-375和WM-115细胞的增殖能力、细胞周期和凋亡、迁移能力、活性氧(ROS)水平和Wnt-β-catenin通路及其下游相关基因和相关蛋白表达的影响。利用ULCAN和GEPIA2数据库分析黑色素瘤中Wnt-β-catenin通路的激活与患者预后的关系。结果:与对照组比较,橙花叔醇处理组A-375和WM-115细胞的增殖能力受明显抑制(均P<0.01)、细胞周期阻滞于G2/M期(P<0.05或P<0.01)、细胞凋亡率增加(均P<0.01)、迁移能力降低(P<0.05或P<0.01)、ROS水平升高(均P<0.01)、Wnt-β-catenin通路被抑制而其下游基因和蛋白表达明显上调(均P<0.01)。数据库数据分析显示,WNT1基因高表达患者OS低于低表达患者(P<0.01)。结论:橙花叔醇通过上调A-375和WM-115细胞中ROS水平影响Wnt-β-catenin通路,从而抑制其恶性生物学行为;Wnt-β-catenin通路可能是黑色素瘤治疗的潜在靶点。

UPLC-Q-TOF-MS法分析枇杷叶的倍半萜苷类化合物

目的采用超高效液相-四级杆-飞行时间串联质谱(UPLC-Q-TOF-MS)技术对分离得到的枇杷叶总倍半萜苷类成分进行定性分析,并对其裂解途径进行研究总结。方法枇杷叶乙醇提取物经大孔树脂、聚酰胺柱色谱和RP-18柱色谱处理后,得到的枇杷叶总倍半萜苷采用Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6 mm×100 mm,1.8μm),甲醇-0.1%甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱,ESI源负离子模式下采集质谱数据。结果从总倍半萜苷中得到5个倍半萜苷类化合物,其二级质谱裂解规律均相同,表现为逐个脱去寡糖链上的糖基,产生特征碎片离子m/z 675、529、383,最后生成m/z 205的特征苷元碎片。结论其中2个倍半萜苷类成分可能是仅在苷元C-6和C-7位上构型有差异的loquatifolin A和6,7-cis-nerolidol-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)]-β-D-glucopyranoside。

HPLC法测定不同产地降香中橙花叔醇的含量

目的:建立降香药材中橙花叔醇的含量测定方法并比较不同产地降香中橙花叔醇的含量。方法:色谱柱:迪马公司 Dia-monsil C_(18)(200 mm×4.6 mm,5μm),流动相:甲醇-水(80:20),流速:1.0 mL·min^(-1),检测波长:220 nm。结果:橙花叔醇在1.9～186.0μg范围内线性关系良好(r=0.9995),平均回收率为98.9%(RSD=1.2%),不同产地药材中橙花叔醇的含量范围为0.017%～0.670%。结论:不同产地的降香药材中橙花叔醇含量存在显著性差异。

橙花叔醇植物资源及利用的研究

讨论了芳香药用植物秘鲁香、吐鲁香及降香黄檀的分布、生长环境及适应性．西双版纳热带植物园引种栽培表明，它们有各自的生育节律和生态适应幅度．这三种植物的树干和根产生的香树脂，可用于提取芳香油，主要成分为橙花叔醇（Ｎｅｒｏｌｉｄｏｌ），含量为５０．７９％～８０．９２％．引种的秘鲁香和吐鲁香精油的主要成分不同于原产地，而原产地的主要成分为肉桂酸苄酯（Ｃｉｎｎａｍｅｉｎ）、肉桂酸（Ｃｉｎｎａｍｉｃａｃｉｄ）、苯甲酸苄酯（Ｐｈｅｎｙｌｂｅｎｚｏａｔｅ）等．

气相色谱法测定不同商品来源降香药材中挥发油和反式苦橙油醇的含量

目的建立降香药材及降香挥发油中反式苦橙油醇的含量测定方法,并比较不同商品来源降香药材中降香挥发油及反式苦橙油醇含量。方法采用气相色谱法,RTX-1701弹性石英毛细管柱（320μm×15 m,0.25μm）,以FID为检测器,内标为正十四醇。结果降香药材中挥发油的含量为1.01%-2.70%,挥发油中反式苦橙油醇的含量为40.35%-53.30%,反式苦橙油醇在0.15-0.42 mg/mL范围内呈良好的线性关系,平均回收率为98.81%。结论采用水蒸气蒸馏法提取降香挥发油和采用气相色谱法测定降香挥发油中反式苦橙油醇的含量,方法简便,可行;9个不同商品来源的降香挥发油的含量差别较大,挥发油中反式苦橙油醇的含量也有差别。

柱切换色谱法同时测定香丹注射液中水溶性成分及橙花叔醇的含量

目的：采用柱切换程序进样高效液相色谱法对香丹注射液中高含量水溶性成分（丹参素、原儿茶醛和丹酚酸B）及微量挥发性成分橙花叔醇（含量相差近3个数量级）的含量进行测定。方法：以Agilent SB-C18预柱为预处理柱，Lichrospher C18（4．6min×250mm，5μm）为分析柱；预处理流动相为1％醋酸水溶液-乙腈，梯度洗脱，流速0．5mL·min^-1；分析流动相为0．05％醋酸水溶液-乙腈，梯度洗脱，流速1．0mL·min^-1；检测波长：0min，280nm，40min，210nm；柱温40℃；进样程序及进样量为：0min，10灿供试品溶液1；15．3min，200μL供试品溶液2。结果：丹参素、原儿茶醛、丹酚酸B和橙花叔醇在实验浓度范围内线性关系良好（R^2〉10．9990）；平均加样回收率在100％-102％，RSD小于3．0％；丹参素、原儿茶醛、丹酚酸B和橙花叔醇的检出限分别为17．1，0．473，60．2，50．6μg·L^-1。结论：方法简便、灵敏，重复性与加样回收率良好，可用于香丹注射液质量分析。

催化剂对橙花叔醇异构化反应影响的研究

钒铝钨酸盐类无机催化剂、原钒酸酯类和原钒酸硅酯类有机催化剂均可对橙花叔醇 的催化异构化反应起作用。研究结果表明,3类催化剂中催化效果较好的分别是偏钒酸铵、 原钒酸丁酯和原钒酸三苯基硅酯,它们作为单一催化剂均可使橙花叔醇发生较好的异构化反 应,金合欢醇的产率分别为37．1％、37．2％和32．O％。在单一催化剂对比研究的基础上,将 偏钒酸铵、原钒酸丁酯和原钒酸三苯基硅酯等3种比较好的催化剂进行了多元复配应用试验,研究结果表明, 这3种催化剂的复配应用虽然可以轻微提高橙花叔醇异构化反应效果,但未表现出明显的增效和协同作用。

吉法酯合成工艺研究

以橙花叔醇、原乙酸三甲酯、香叶醇为主要原料,经Claisen重排、水解、缩合反应得到标题化合物。用精馏的方法得到符合要求的吉法酯构型。经气相色谱分析确证其Z/E构型比例为29.52∶70.48,纯度为99.91%,总收率41.4%。

合成(反)-β-法尼烯的绿色意义

(反 ) β 法尼烯是蚜虫的报警信息素 ,极具发展潜力 .利用 (反 ) β 法尼烯具有驱散蚜虫的特点 ,用于温室或大棚中可以防治蚜虫 :将 (反 ) β 法尼烯与常规杀虫剂混用 ,将驱使蚜虫主动接触杀虫剂 ,在动态中被灭杀 ,此法将降低杀虫剂的用量 ,有利于环境保护、有利于食物的安全、有利于对害虫天敌的保护 .国内已有使用蚜虫报警信息素方法的成果发表 .目前这一研究领域的最主要问题是获取廉价易得的 (反 ) β 法尼烯 。

气相色谱法测定降香挥发油中反式苦橙油醇的含量

目的:建立降香挥发油中反式苦橙油醇的气相色谱含量测定方法。方法:采用AgilentHP-5柱(320μm×30m,0.25μm);流动相高纯N2,流速2mL·min-1。结果:反式苦橙油醇在0.059-1.97mg·mL-1呈良好线性关系(r=0.9997),平均回收率97.5%,重复性RSD2.3%。结论:本法简便,准确且重复性好,可有效控制该药材挥发油中反式苦橙油醇的含量。

以绿色化学原则指导蚜虫报警信息素的合成

(反)-β-法尼烯是蚜虫的报警信息素,极具发展潜力.利用(反)-β-法尼烯具有驱散蚜虫的特点,用于温室或大棚中可以防范蚜虫;将(反)-β-法尼烯与常规杀虫剂混用,可驱使蚜虫主动接触杀虫剂,在动态中被灭杀,此法将降低杀虫剂的用量,有利于环境保护、有利于食物的安全、有利于对害虫天敌的保护.国内已有使用蚜虫报警信息素方法的成果,国内外发表了许多研究成果.目前这一研究领域的最主要问题是获取廉价易得的(反)-β-法尼烯.目前的合成方法与合成工艺不具备批量生产的能力.本文提出减压流态化合成的新工艺,将使蚜虫报警信息素的广泛应用得到支持.

樟树MVA途径基因克隆与表达模式初探

【目的】克隆樟树MVA途径系列基因,初步研究其表达模式及分析其表达水平与倍半萜含量的关系,为解析樟树精油倍半萜类成分生物合成机制提供理论依据。【方法】基于转录组与基因组数据,PCR克隆MVA途径系列基因。进一步借助荧光定量PCR,聚类分析系列基因在橙花叔醇型樟树不同组织与不同化学型樟属植物叶组织中的表达模式。挑选代表性单株,关联分析在不同时令下系列基因表达量与倍半萜含量。【结果】橙花叔醇型樟树叶、叶柄、花与花梗等4个组织精油主要成分为倍半萜类化合物,小枝与树皮精油主要成分为单萜类化合物,而根组织精油主要成分则为苯丙素类化合物。樟树MVA途径11个序列基因在不同组织中可分为3种不同表达模式。其中,HMGS2、HMGR2与IDI1等3个基因具有类似的表达模式,即在富含倍半萜类化合物组织中优势表达。进一步分析HMGS2、HMGR2与IDI1等3个基因在不同化学型樟属叶组织表达模式,结果显示三者在倍半萜型单株叶组织中表达量是其它化学型的3.26~6.07倍。在小群体分析中,不同时令下HMGS2、HMGR2与IDI1等3个基因表达丰度与倍半萜累积速度相关,但与单株间倍半萜含量无明显相关性。【结论】樟树部分MVA途径系列基因即HMGS2、HMGR2与IDI1等存在共表达模式,在转录水平上三者对樟树倍半萜类化学型形成及不同组织倍半萜类化合物差异性分布具有重要调控作用,但不同单株间叶组织中倍半萜类化合物含量多寡可能还受其它因素调控。

海南木莲叶挥发油化学成分研究

目的:分析海南木莲叶的挥发油成分。方法:采用水蒸气法提取挥发油,气相色谱-质谱-计算机联用技术分析。结果:共鉴定出49种化合物,占挥发油总量的99.99%,其中主要成分是橙花叔醇(16.44%);3,7-二甲基-2,6-辛二烯-1-醇(5.27%);3,7-二甲基1,6-辛二烯-3-醇(5.12%);α-丁香烯(4.97%)和丁香烯(4.48%)。

HPLC法测定降香挥发油羟丙基-β-环糊精包合物中反式-橙花叔醇

[目的]建立用H PLC法测定降香挥发油羟丙基-β-环糊精包合物中反式-橙花叔醇的方法。[方法]色谱柱:D iam onsil C18(250×4.6m m,5μ);流动相∶甲醇-水(85∶15);流速:1.0m L/m in;检测波长:210nm;柱温30℃。[结果]反式-橙花叔醇线性范围为0.1×10-5～0.6×10-3μL,r=0.9999,加样回收率为102.62%,R SD为1.314%(n=9)。[结论]本方法简便、快速,精密度、重现性好,可以作为降香挥发油羟丙基-β-环糊精包合物的质量控制方法。

不同商品来源降香药材中挥发油质量研究

建立降香药材所含挥发油相对密度及反式苦橙油醇含量测定方法,并对不同商品来源降香药材进行质量评价。水蒸气蒸馏法提取降香挥发油,采用比重瓶法测定相对密度,气相色谱法测定反式苦橙油醇含量,采用HP-5色谱柱,FID检测器,以正十四烷为内标进行测定。比重瓶法准确性[RAD（相对平均偏差）%〈5%（n=10）]、重复性（RSD 0.04%〈2%）、中间精密度[RAD%〈5%（n=15）]均良好,可替代韦氏比重秤法（用量100 mL）用于降香药材相对密度检测。气相色谱法进样精密度RSD%=0.2%,重复性RSD%=0.5%,稳定性RSD%=0.6%,线性范围为0.203~5.080 mg/mL（r=0.9995）,回收率为100.5%,RSD%=1.37%（n=6）。采用比重称法测定降香药材相对密度,供试品用量少（5 mL）,方法简便可行,气相色谱法简单、灵敏、准确、重线性好,适用于降香油中反式苦橙油醇含量的测定,不同商品来源降香药材出油率、相对密度、反式苦橙油醇含量差别较大,分别为1.72%~3.50%、0.8680~0.9294/20℃、40.4%~85.4%。

液相色谱串联质谱法测定大鼠血浆中反式-橙花叔醇质量浓度

目的建立测定大鼠血浆中反式-橙花叔醇质量浓度的液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)法,并用于药代动力学(PK)研究。方法大鼠灌胃50 mg/kg反式-橙花叔醇,给药后特定时间点采血,以磺胺甲噁唑为内标,血浆样品采用乙腈沉淀蛋白处理。色谱柱为Synergifusion-RPC_(18)柱(50 mm×3.0 mm,4μm),流动相为乙腈-含0.1%甲酸和1 mmol/L乙酸铵的水溶液(40∶60,V/V),流速为400μL/min。采用电喷雾离子源,正离子模式,多反应监测模式。建立标准曲线,计算血药浓度,根据血药浓度建立血药浓度-时间曲线,并计算主要PK参数。结果含药血浆标准曲线的质量浓度线性范围为0.01~40μg/mL,相关系数(r)为0.9972(n=10);定量下限为0.01μg/mL;反式-橙花叔醇日内精密度试验的RSD≤6.20%,日间精密度试验的RSD≤7.67%;提取回收率≥(91.28±4.94)%。反式-橙花叔醇在大鼠血浆中稳定性良好,主要PK参数峰浓度(C_(max))为(21.38±3.08)μg/mL,半衰期(t_(1/2))为(1.950±0.346)h,0~t药时曲线下面积(AUC_(0-t))为(52.62±10.37)μg/(mL·h),表观分布容积(V_(Z/F))为(2.660±0.333)L/kg,0~t平均驻留时间(MRT_(0-t))为(2.650±0.341)h。结论所建立的LC-MS/MS法准确、可靠,可用于大鼠血浆中反式-橙花叔醇的质量浓度测定及其PK研究。

高等植物的次级代谢—C_(11)和C_(16)萜烯同系物和间接自我保护

［２Ｈ５］－橙花叔醇，［２Ｈ５］－咙牛儿基沉香醇和糖甙酶等为底物，对５０多种单子叶和双子叶植物进行培养实验，证明许多高等植物尤其是大多数农作物在被害虫侵袭时，叶片中所含橙花叔醇糖甙被水解产生游离醇，又在细胞内的氧化裂解酶的作用下产生次级代谢，表现为其次级代谢物将大大增多，其中萜类以及Ｃ１１、Ｃ１６萜烯同系物的含量增加更加显著。许多试验表明，植物以此引诱害虫天敌，实现自我保护。