微囊化NGF基因修饰NIH3T3细胞对体外培养的组织工程皮肤功能的影响

神经生长因子(Nerve growth factor,NGF)能促进周围神经再生,还能加速创面收缩和再上皮化。本实验采用微囊和组织工程研究技术,探讨构建微囊化转NGF基因NIH3T3细胞复合组织工程真皮的可行性及其生物效应。我们将NGF基因修饰的NIH3T3细胞包裹在海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠微囊内体外培养,夹心ELISA法测定其上清NGF含量,将此微囊与人表皮细胞、成纤维细胞共培养一周后行MTT、羟脯氨酸(HP)测定、超微结构及组织形态学观察。用组织工程皮肤培养系统构建复合微囊的组织工程真皮,HE染色、羟脯氨酸测定和扫描电镜观察其生物功能及活性。我们发现:转NGF基因微囊体外培养8周,仍稳定分泌NGF,能促进人表皮细胞增殖,促进人成纤维细胞分泌胶原,复合组织工程真皮后仍保持此功能。因此,将微囊和转基因技术结合构建组织工程皮肤是可行的。

Lhx8基因沉默抑制NGF诱导的海马NSCs向胆碱能神经元分化的研究

目的:明确Lhx8在神经生长因子(nerve growth factors,NGF)促进海马神经干细胞向胆碱能神经元分化中的作用。方法:体外培养海马神经干细胞并应用NGF促进其向胆碱能神经元分化的过程中,将构建的Lhx8干扰慢病毒加入至培养液中,7 d后应用免疫荧光标记技术检测分化所得胆碱乙酰转移酶(choline acetyltransferase,Ch AT)和微管相关蛋白-2(microtubule-associated protein 2,MAP-2)双标阳性细胞。结果:在空白对照组中,仅检测到少量的Ch AT/MAP-2双标阳性细胞;在NGF组或是NGF联合阴性对照慢病毒组中则可检测到较多的Ch AT/MAP-2双标阳性细胞;在加入Lhx8干扰慢病毒的实验组中,分化所得的Ch AT/MAP-2双标阳性细胞数较NGF组或是NGF联合阴性慢病毒组明显减少。结论:Lhx8基因沉默抑制了NGF诱导的海马神经干细胞向胆碱能神经元的分化。

NGF-β、GFP基因修饰大鼠胚胎中脑神经干细胞的建立

目的建立神经生长因子β(NGF-β)基因修饰大鼠胚胎中脑神经干细胞。方法以质粒pcDNA3-hNGFb、pEGFPN1共转染大鼠胚胎中脑神经干细胞,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)在细胞内的表达,免疫细胞化学、Western blot鉴定NGF-β在细胞内的表达。体外诱导分化,免疫细胞化学鉴定其分化能力。结果GFP在基因转染12h后开始表达,免疫细胞化学、Western blot结果表明NGF-β能在细胞中正确表达且NGF-β、GFP基因修饰不影响其增殖与分化。结论成功建立NGF-β、GFP基因修饰大鼠胚胎中脑神经干细胞。

微囊化NGF基因修饰NIH3T3细胞移植对慢性创面愈合的影响

目的探讨微囊化转NGF基因NIH3T3细胞移植作用于慢性缺血性创面的方法及其对创面愈合的作用。方法将转NGF基因的NIH3T3细胞包入APA(海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠)微囊中培养备用,分别采取创面NGF微囊悬液局部注射法、NGF微囊复合组织工程真皮法、NIH3T3微囊局部注射法、NGF(5ng／ml)局部注射法、胶原膜法等应用于大鼠背部缺血性创面模型,以空白创面为时照,观察创面再上皮化、愈合速度及愈合时间。结果两种微囊应用方法均可促进创面上皮化速率,提高创面愈合的速度,与对照组相比差异显著(p<0．05),其中以微囊复合组织工程真皮法效果最为明显。结论应用转NGF基因微囊可促进慢性缺血性创面的愈合。

牦牛NGF基因克隆及其在生殖器官中的表达定位

旨在探究NGF基因的生物学特性及其在母牦牛生殖器官中的表达特性。本研究收集黄体期母牦牛的心、肝、脾、肺、肾以及胎牛期、卵泡期、黄体期、妊娠期母牦牛的卵巢、子宫和输卵管(n=3),利用RT-PCR克隆牦牛NGF基因,并对其序列进行生物信息学分析,利用RT-qPCR技术分析NGF基因的组织表达特性,利用免疫组化技术(IHC)定位NGF蛋白在牦牛生殖器官中的表达分布。结果显示,牦牛NGF基因CDS区全长为726 bp,共编码241个氨基酸,编码的蛋白质属于碱性不稳定亲水蛋白;NGF氨基酸系统进化树结果显示,牦牛首先与黄牛聚为一类,与其他物种的同源性均高于87%,说明该基因在进化过程中表现出高度保守性。RT-qPCR结果显示,牦牛NGF基因在卵巢中的表达量极显著高于心、肝、肾、脾、肺、子宫和输卵管(P<0.01)。黄体期卵巢中NGF的相对表达量最高,极显著高于胎牛期、卵泡期和妊娠期(P<0.01);妊娠期子宫NGF相对表达量较高,显著高于胎牛期和卵泡期(P<0.05);各时期输卵管的NGF mRNA表达差异不显著。IHC结果显示,NGF蛋白主要在牦牛卵泡的颗粒细胞和卵巢上皮层细胞中表达,且在颗粒层细胞表达最高;在子宫内膜和输卵管的黏膜上皮细胞也有表达。综上,牦牛NGF基因序列在进化过程中较为保守,在卵巢中表达量较高,可能在维持母牦牛卵巢机能和妊娠以及促进黄体功能方面发挥重要的调控作用。

人神经生长因子的基因克隆和序列分析

目的 克隆人神经生长因子基因编码区。方法 由人末梢血白细胞中提取细胞总DNA ,利用PCR法 ,从DNA中扩增出人神经生长因子编码区基因DNA片段 ;将获得的基因片段插入 pGEM T Easy质粒中 ,转化到大肠杆菌DH5α后挑选阳性克隆 ,利用限制性内切酶酶切核苷酸序列分析技术鉴定重组质粒。结果 经质粒DNA酶切分析及序列测定 ,获得了人神经生长因子DNA片段序列。结论 首次由人白细胞DNA中克隆获得了人神经生长因子基因 ,为神经生长因子的基因治疗提供了前提条件。

脂质体介导人β-神经生长因子基因转染培养肌母细胞的表达研究

目的 了解含 β-神经生长因子 (β- NGF)基因的表达质粒 PSVCEP NGF- CAT在培养肌母细胞中的表达及 L ipofect AMINE阳离子脂质体介导的转染效率。方法 将表达质粒 PSVCEP NGF- CAT经 L ipofectAMINE转染至培养成的肌母细胞中 ,用免疫细胞化学方法检测基因在肌母细胞内的表达。结果 培养肌母细胞在转染 6小时吞噬脂质体最显著 ,转染 48小时后约 40 %的肌母细胞胞质内有β- NGF基因表达。结论 含β- NGF基因的表达质粒 PSVCEP NGF- CAT可以在培养肌母细胞中表达 ,脂质体转染的方法简便。

艾司氯胺酮对大鼠骨折后骨生长相关因子的影响

目的 建立大鼠胫骨骨折模型,观察给予艾司氯胺酮后骨生长相关因子的变化趋势。方法 选取48只雄性SD大鼠建立胫骨骨折模型后,随机均分为2组:实验组(腹腔注射艾司氯胺酮40 mg·kg^(-1)·24 h^(-1),稀释至1 ml),对照组(腹腔注射0.9%氯化钠溶液1 ml),分别于骨折模型建立后第1周、2周、4周取血清并保留大鼠右侧胫骨行脱钙处理,酶联免疫吸附法(ELISA)测血清中降钙素相关基因肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)、胰岛素生长因子1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)、神经生长因子(nerve growth factor,NGF)浓度,观察三种因子在骨折愈合中的变化趋势,HE染色观察骨痂部位骨组织的形态学和细胞学。结果 实验组的骨痂体积、新生骨细胞、新生毛细血管均多于对照组(P<0.05),实验组CGRP、IGF-1在各时间点均高于对照组(P<0.05),且CGRP及CGF-1在血清中随时间变化逐渐呈升高趋势,NGF在1周时明显升高,但在2周和4周时较对照组明显降低(P<0.05)。结论 艾司氯胺酮促进骨折愈合过程中,CGRP、IGF-1及NGF可能是促进骨折愈合的相关因素。