Nestin转基因小鼠模型的建立及nestin基因在器官中的表达

目的构建人nestin基因表达载体,制备nestin过表达转基因小鼠。方法以人神经胶质瘤细胞株U251的cDNA为模板,分3段扩增出nestin基因cDNA全序列,并将其克隆入含有强启动子ROSA26的pBROAD3载体,酶切鉴定、测序,除去原核序列,纯化。显微原核注射建立转基因小鼠。PCR验证nestin基因整合,确定建立首建者。将阳性鼠传代。Western blot方法检测F3代转基因小鼠与野生型小鼠主要器官(心、肺、脑、肾)的nestin表达。结果测序结果证明成功构建了受ROSA26启动子调控的nestin转基因载体。出生34只小鼠,PCR检测证实存在首建者2只。Western blot方法证实,与野生型小鼠相比,F3代转基因小鼠脑、肺组织存在较高水平nestin表达。结论首次成功建立nestin过表达转基因小鼠,外源基因可遗传到子代并在脑和肺组织中稳定表达,为深入研究nestin在肿瘤转移、细胞"干性"的维持和细胞的分化等功能提供了良好的实验动物模型。

慢病毒介导的Nestin基因沉默抑制人食管癌ECA109细胞增殖

目的通过体外实验探讨沉默巢蛋白(Nestin)基因对人食管癌ECA109细胞增殖能力的影响及可能机制。方法合成Lenti-Nestin慢病毒载体,实验设blank组、scrambled组和Lent-Nestin组,转染ECA109细胞,建立稳定沉默Nestin基因的细胞系Lenti-Nestin;用qRT-PCR和Western blot检测Nestin、c-myc和cyclin D1 mRNA和蛋白表达;CCK-8法检测细胞增殖能力;平板集落实验检测细胞的集落形成。结果稳定沉默Nestin的细胞系构建成功;与blank组和scrambled组相比,Lent-Nestin组中Nestin mRNA(P<0.01)和蛋白(P<0.05)水平明显降低;细胞增殖能力明显降低(P<0.01),集落形成能力显著下降(P<0.05);沉默Nestin表达后,c-myc、cyclin D1表达明显受到抑制(P<0.05)。结论沉默Nestin基因表达可抑制人食管癌ECA109细胞的增殖能力,其可能通过调控c-myc、cyclin D1表达参与其中。

抗nestin多克隆抗体的制备

目的: 在大肠杆菌中融合表达编码小鼠nestin肽链C段的cDNA序列,制备特异性多克隆抗体;方法: 采用RT PCR的方法获得编码小鼠nestin肽链C段的cDNA序列,将测序正确的片段克隆入pET 32a,构建pET 32a nestin C表达载体.在大肠杆菌BL 21中IPTG诱导下表达6×Hisnestin C融合蛋白,纯化后免疫新西兰兔,制备兔抗鼠nes tin血清,以WesternBlotting和免疫组化方法分析其特异性.结果: 6×His nestin C融合蛋白免疫新西兰兔成功获得多克隆抗体,WesternBlotting和免疫组化结果显示制备的抗体具有较高的特异性.结论: 构建了pET 32a nestin C表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达.该多克隆抗体效价高、特异性好.

成人骨髓源性神经干细胞中nestin表达的实时定量RT-PCR检测

目的建立快速获取成人骨髓源性神经干细胞(Human adult bone marrow-derived neural stem cells,Md-NSCs)的方法,并对Md-NSCs中神经巢蛋白nestin的表达进行定量比较分析。方法抽取成人志愿者全骨髓,梯度离心分离成人骨髓基质细胞(human adult bone marrow stromal cells,hMSCs),贴壁培养法纯化及扩增hMSCs;以神经干细胞培养基体外诱导培养hMSCs成为成人骨髓源性神经干细胞(Human a-dult bone marrow-derived neural stem cells,Md-NSCs);以实时定量RT-PCR检测Md-NSCs中nestin基因的表达,以hMSCs作为对照组。结果hMSCs呈长梭形,贴壁生长,于体外诱导培养可快速有效地获取Md-NSCs,Md-NSCs不贴壁生长,由神经干细胞克隆组成神经球样结构;Md-NSCs中nestin基因的表达比hMSCs增高2.04×102倍。结论hMSCs经诱导分化成为Md-NSCs后细胞的生物特征发生显著改变,Md-NSCs高度表达神经巢蛋白nestin具有神经干细胞的特征,并非hMSCs的简单聚集成球。

应用CRISPR／Cas9慢病毒系统建立Nestin基因敲除的小鼠肾足细胞系

目的基于CRISPR／Cas9系统构建稳定敲除Nestin基因的条件永生性小鼠肾足细胞株（mouse podocyte，MP）。方法利用Cas9过表达慢病毒构建条件性永生小鼠足细胞Cas9过表达稳转细胞系（CAS9／MP）。设计Nestin基因的3个位点（KO1、KO2、KO3），并构建3对靶向Nestin基因的sgRNA寡核苷酸序列，将其连接进GV371质粒中，测序验证后，包装慢病毒颗粒，感染构建好的CAS9／MP，嘌呤霉素筛选（Puromycin）阳性克隆细胞，Cruiser TM酶切检测CAS9-sgRNA对目的基因的剪切活性。结果成功构建了CAS9／MP及GV371-Nes-sgRNA重组载体，Cruiser TM酶法验证表明，CAS9-sg RNA2有剪切活性。结论建立能稳定敲除Nestin基因的CRISPR／Cas9慢病毒系统，成功获得Nestin敲除的MP稳转细胞株。为进一步研究Nestir在足细胞中的作用机制奠定基础。

巢蛋白mRNA在小鼠中枢神经系统发育过程中的表达

巢蛋白（Nestin）属于中等纤维基因家族，在增殖较快的神经前体细胞中表达。该基因被克隆后，作为神经前体细胞的标记基因得到广泛应用。本文中，我们根据小鼠巢蛋白cDNA序列，设计了一对引物，在确定了反转录PCR反应的最佳反应条件后，详细地考察小鼠巢蛋白mRNA在中枢神经系统发育过程中的表达规律，发现巢蛋白mRNA在小鼠第10天胚胎的脑中表达，到第14天表达量达到最高，后下降；在出生后的小脑中，表达也有类似规律，出生后第5天，表达量最高，其后下降。在成年小鼠各组织中，均未检测到巢蛋白mRNA的表达。

乳鼠海马神经干细胞向神经细胞分化过程中Notch1 mRNA的表达

目的建立神经干细胞(NSC)向神经细胞分化的培养体系,探讨Notch1mRNA在NSC分化过程中的表达情况。方法无菌分离新生(24h)SD大鼠海马NSC,体外扩增、纯化,并诱导NSC向神经细胞分化。细胞诱导前、后,采用免疫荧光化学法鉴定巢蛋白(Nestin)和神经元特异性烯醇酶(NSE)的表达;用逆转录-PCR检测NSC中Notch1mRNA的表达情况。结果从乳鼠海马分离的NSC在体外能克隆增殖,并表达Nestin。诱导分化后,细胞NSE阳性表达;Notch1mRNA在NSC诱导分化前、后均有表达。与诱导前相比,NSC诱导分化后各阶段Notch1mRNA表达水平均明显降低(P<0.05),而NSC分化各阶段Notch1mRNA表达的差异无统计学意义(P>0.05)。结论诱导NSC向神经细胞分化能抑制其Notch1mRNA的表达,低水平的Notch信号可能有利于神经细胞的分化。

肌苷对脑缺血再灌注损伤神经细胞巢蛋白表达的影响

①目的 研究大鼠缺血性脑损伤后神经细胞巢蛋白 (Nestin)变化的规律 ,探讨肌苷治疗中枢神经缺血性损伤的作用机制。②方法 成年健康雌性SD大鼠 6 8只 ,以线栓法建立大脑中动脉缺血再灌注模型。随机分为治疗组 (腹腔注射 5 0 g/L肌苷 10 0mg/kg)和对照组 (腹腔注射生理盐水 10 0mg/kg) ,每组再随机分为缺血1.5h再灌注 2h、6h、12h、2 4h、2d、3d、7d、14d组 (n =4 ) ,另取 4只作假手术组。应用原位杂交技术检测脑缺血再灌注后脑组织Nestin的表达。③结果 假手术组皮质、纹状体和室旁区Nestin表达很弱。对照组缺血侧皮质除 2h以外、纹状体除 2、6h以外、室旁区除 2h、6h、14d以外各时间点Nestin的表达均明显高于假手术组 (t =1.95～4 7.2 1,P <0 .0 5 )。治疗组Nestin表达较对照组在皮质于 2h、6h、7d、14d、在纹状体于 14d有所降低 ,在皮质、纹状体及室旁区于 3d均显著升高 ,在纹状体、室旁区于 7d显著升高 (t=4 .37～ 18.0 3,P <0 .0 5 )。④结论 肌苷可以促进大鼠脑缺血再灌注后Nestin的表达 ,可能具有促进神经干细胞生成的作用。

脑缺血再灌注损伤后神经细胞增殖相关因子基因的表达

目的:观察大鼠脑缺血再灌注后神经细胞巢蛋白、干细胞因子(SCF)和神经细胞粘附分子(NCAM)基因的表达。方法:成年SD大鼠,以线栓法建立大脑中动脉缺血再灌注模型,随机分为缺血1.5 h再灌注2 h^14 d组和假手术组。原位杂交技术检测脑缺血再灌注后脑组织巢蛋白SCF和NCAM mRNA的表达。结果:脑缺血再灌注后,巢蛋白mRNA表达在大部分时相点,均明显高于假手术组。SCF mRNA的表达除早期时相点外,均明显高于假手术组。NCAM mRNA于再灌注2 h后开始表达,12 h^1 d达高峰,7 d后逐渐减少,14 d降至假手术组水平。结论:脑缺血再灌注后SCF mRNA表达可能具有促进神经干细胞增殖作用,NCAM表达可能参与了损伤后脑组织的修复过程。

神经前体细胞的分离培养及绿色荧光蛋白基因的转染

【目的】为替换中枢神经损伤后死亡的神经元提供方便追踪观察的神经前体细胞。【方法】应用含碱性成纤维生长因子 (bFGF)的无血清培养技术 ,从新生大鼠海马组织分离培养神经前体细胞 ,并借助免疫组织化学技术检测这些细胞巢蛋白 (nestin)的表达以及细胞分化后神经丝蛋白 (NF)和胶质原纤维酸性蛋白 (GFAP)的表达。采用磷酸钙法将绿色荧光蛋白(GFP)基因转染目的细胞内。【结果】从海马组织分离的细胞具有分裂能力 ,能表达nestin。分化后一些细胞能表达NF ,而另一些细胞则表达GFAP。GFP基因修饰的细胞能发出荧光。【结论】从海马组织分离的细胞能表达nestin ,属于神经前体细胞 ,它们具有明显的增殖能力。有些神经前体细胞已经分化为神经元和神经胶质细胞。GFP基因已成功转染到神经前体细胞内 ,并表达了GFP。

巢蛋白对缺血心肌损伤再修复影响

目的:探讨巢蛋白对心肌梗死后大鼠缺血心肌再修复的影响。方法:将雄性Sprague-Dawley大鼠30只随机分为对照组、心肌梗死损伤组及心肌梗死损伤修复组,每组各10只;心脏超声检测左室舒张末内径(LVEDD)、左室收缩末内径(LVESD)、左室射血分数(LVEF)、左室缩短分数(FS)。HE染色光镜下观察大鼠心肌形态学改变。Western检测心肌细胞巢蛋白、NKX2.5、GATA4表达。结果:心梗损伤组和心梗修复组均可见心肌细胞肥大,心梗损伤组还出现部分心肌细胞坏死,与心梗损伤组相比,心梗修复组大鼠心肌病理形态、左室大小、射血分数明显改善,巢蛋白、NKX2.5、GATA4表达明显增加(P<0.01)。结论:心肌发生缺血损伤后巢蛋白的表达会增加,巢蛋白参与了损伤心肌的再修复,对损伤心肌具有修复作用。

脑缺血再灌注损伤后神经细胞增殖相关因子基因的表达(英文)

目的观察大鼠脑缺血再灌注后神经细胞巢蛋白(Nestin)、干细胞因子(SCF)和神经细胞黏附分子(NCAM)基因的表达。方法成年健康雌性SD大鼠36只,以线栓法建立大脑中动脉缺血再灌注模型,随机分为缺血1.5 h再灌注2 h、6 h、12 h、24 h、2 d、3 d、7 d、14 d组和假手术组,每组4只。应用原位杂交技术检测脑缺血再灌注后脑组织Nestin、SCF和NCAM mRNA的表达。结果假手术组皮质和纹状体区Nestin、SCF和NCAMmRNA均有微弱表达。脑缺血再灌注后Nestin mRNA表达增高,皮质除再灌注2 h以外、纹状体除再灌注2、6 h以外,其余各时间点均明显高于假手术组。SCF mRNA表达,皮质除再灌注2、6、12 h以外,纹状体除再灌注2、6 h以外,其余各时间点均明显高于假手术组。NCAM mRNA于再灌注2 h后在皮质和纹状体区开始表达,分别于再灌注12 h和1 d达高峰,7 d后逐渐减少,14 d降至假手术组水平。结论脑缺血再灌注后SCF mRNA表达可能具有促进神经干细胞增殖作用,NCAM表达可能参与了损伤后脑组织的修复过程。

血清诱导乳鼠骨髓间充质干细胞表达胰岛样细胞基因效果观察

目的观察血清诱导乳鼠骨髓间充质干细胞(MSC)表达胰岛样细胞基因的效果。方法 SD乳鼠10只,手术分离胫骨和股骨,分离、培养MSC,分别采用5%(对照组)、10%(低浓度组)和20%(高浓度组)的胎牛血清(FBS)刺激。纯化至第4代时以MTT法检测MSC增殖趋势;诱导14 d时用RT-PCR检测MSC细胞中的巢素蛋白(Nestin)、胰十二指肠同源性盒因子-1(PDX-1)、Insulin mRNA,用免疫荧光法检测Nestin、PDX-1、Insulin蛋白。结果随着血清浓度增高与刺激时间延长,MSC呈现明显的增殖趋势,细胞形态发生改变,形成胰岛β细胞轮廓。高浓度组MSC Nestin mRNA表达低于对照组,PDX-1、Insulin mRNA表达高于对照组(P均<0.05)。诱导14 d时Insulin、Nestin、PDX-1蛋白表达与7d时比较,P均<0.05。结论血清诱导下乳鼠MSC中胰岛相关基因PDX-1、Insulin表达上调,Nestin表达减少,显示MSC在一定条件下可被定向诱导分化成胰岛样细胞。

Differentiation of embryonic stem cells transfected by ibeB gene

We have previously identified an E. coli deter- minant, ibeB gene locus contributing to invasion of human brain microvascular endothelial cells. In the present study, we established embryonic stem (ES) cell lines overexpressing IbeB and found that exogenic ibeB gene could start-up expression of a neural stem cell specific marker, nestin, and give rise to polar changes. In analysis of IbeB location, it was found that GFP-IbeB fusion protein targeted at the ES cell nucleus. These data suggests that ibeB gene may play an important role in the regulation of nestin expression.

神经干细胞特异性调控启动子研究

目的研究神经干细胞特异性调控启动子。方法 PCR扩增出小鼠nestin基因启动子全序列(4 000 bp)、核心序列(400 bp)和内含子-2;以pcDNA3.1为模板,构建6种重组质粒,分别用CMV、CMV+内含子-2、nestin基因启动子全序列、nestin基因启动子全序列+内含子-2、nestin基因启动子核心序列、nestin基因启动子核心序列+内含子-2作为启动子调控报告基因EGFP表达;6种重组质粒分别转染nestin^+、nesti^-细胞,荧光显微镜下观察转染后细胞内EGFP表达,同时采用流式细胞仪法测定表达EGFP细胞表达率。结果 nestin基因启动子全序列及核心序列都能非特异性调控EGFP基因在细胞内表达,并且具有较强调控能力,与内含子-2融合后,只能特异性调控EGFP基因在nestin^+细胞表达,而CMV启动子与内含子-2序列融合只具有非特异性调控能力。结论 nestin基因启动子全序列与内含子-2协同调控外源基因在nestin^+细胞特异性表达。

骨髓间充质干细胞在先天性脊椎裂胎鼠脊髓中的分化

目的观察大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)在先天性脊椎裂胎鼠脊髓中的存活与分化,探寻细胞替代治疗先天性脊椎裂的方法。方法用贴壁培养法进行大鼠MSC原代培养并传代,携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的腺病毒转染第3代骨髓MSC。将转染的MSC注射到先天性脊椎裂胎鼠的脊髓中。母鼠孕20 d时取先天性脊椎裂胎鼠的脊椎,固定脱水后做冷冻切片,免疫荧光方法检测脊髓中EGFP阳性MSC中巢蛋白(Nestin)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果骨髓MSC中CD90阳性细胞占99%,CD44阳性细胞占95%,不表达CD34。腺病毒-EGFP转染骨髓MSC的转染率为61%。致畸组显性脊椎裂胎鼠占64.3%。移植的MSC存在于脊髓表面或进入脊髓中,部分细胞变为长梭形或多角形。免疫荧光法检测结果显示移植到脊髓中的MSC可表达神经干细胞的标志物Nestin和神经胶质细胞的标志物GFAP。结论带有EGFP的MSC经细胞移植后能在胎鼠脊髓内存活,并能分化为神经干细胞和神经胶质细胞。