正常成年大鼠中枢神经系统内nestin蛋白免疫阳性结构的分布

目的 :观察作为神经前体细胞标记物 中间丝蛋白nestin在成年大鼠中枢神经系统内的分布特征 .方法 :多聚甲醛灌流固定的脑和脊髓组织切片上 ,进行免疫组织化学(ABC法 )染色 .结果 :nestin免疫阳性主要分布于海马齿状回、室管膜及室管膜下区、穹隆下器、正中隆起、最后区等室周器官、以及脑干和脊髓的中缝胶质结构等区域 .nestin反应产物定位在胞体、及其长短不等的星状突起或放射状突起内 .结论 :结果提示 ,在成年鼠脑和脊髓的上述区域内 ,可能仍然存在一定数量呈nestin免疫反应的神经前体细胞 。

Nestin蛋白作为一过性全脑缺血大鼠海马损伤早期敏感性标志物的研究

目的 :研究大鼠一过性全脑缺血后 Nestin蛋白在海马中早期表达的变化规律。方法 :雄性 SD大鼠 ,随机分为正常对照组、手术对照组和损伤组。损伤组动物采用四管夹闭脑缺血模型 ,按照脑缺血术后时间不同再分为 1、3、7、14和 2 1日组。应用免疫组织化学法观察 Nestin蛋白及 GFAP蛋白阳性胶质细胞在海马内的变化规律、计数及形态学分析。结果 :细胞计数显示 ,脑缺血后第 1日 Nestin蛋白阳性胶质细胞在海马中出现 ,缺血后第 7日达到高峰之后降低并在缺血第 14日时恢复至对照组水平 ;GFAP蛋白阳性细胞在缺血后第 3日略有增加 ,第 7日达到高峰之后下调。结论

脑创伤后NGF对神经干细胞Nestin蛋白表达的影响

目的 研究脑创伤后外源性神经生长因子 (NGF)对神经干细胞Nestin蛋白表达的影响及其意义。方法 建立大鼠流体脑创伤模型 ,采用免疫细胞化学及图像分析等方法 ,观察脑创伤后非NGF处理组和NGF处理组Nestin蛋白表达的变化。结果 成年大鼠Nestin阳性细胞主要位于室管膜下组织 ,细胞的形态主要是胶质细胞。脑创伤后Nestin阳性细胞在室管膜下反应性增加 ,以伤后 7d明显 ,同时在创伤区域周围也可见到大量的Nestin阳性细胞 ,并在伤后 14d继续维持其反应性增加。NGF处理组伤后 7dNestin阳性细胞在伤灶周围更加明显 ,为 2 8.7± 3.8,比同时相点的非NGF处理组明显增加 (P <0 .0 1)。结论 外源性NGF能明显促进脑创伤后Nestin阳性细胞数量的增加 ,增强星形胶质细胞对脑创伤的反应并使其表现有神经干细胞的特征 ,参与神经细胞的再生和重塑。

中枢神经系统损伤后神经干细胞及nestin蛋白的变化

神经干细胞是近十多年来在神经生物学领域的重大发现 ,并成为该领域的热点之一。神经干细胞在成年哺乳类动物中枢神经系统中的发现为神经系统损伤及退行性疾病的治疗和康复带来新的希望。目前 ,用异体胎脑或神经干细胞移植进行神经替代治疗的研究已取得一定成果。然而 ,中枢神经损伤后对自体内源性神经干细胞活动及其标记物nestin蛋白的研究也有望在神经替代方面取得突破。

芪棱汤对大鼠脑缺血再灌注后nestin蛋白表达的影响

目的观察芪棱汤对脑缺血再灌注后nestin蛋白表达的影响,为益气养阴活血法治疗缺血性中风提供实验依据。方法将大鼠随机分为假手术组、模型组、芪棱汤去养阴药组及芪棱汤组,采用颈内动脉线栓加环扎法复制大鼠脑缺血再灌注模型。于再灌注后不同时间点进行神经学评分,用免疫组化法检测nestin蛋白表达。结果假手术组神经学评分均正常,其余各组大鼠神经功能评分差异均有显著性,芪棱汤组明显优于其他组;假手术组未见nestin蛋白表达,模型组、芪棱汤去养阴药组和芪棱汤组nestin蛋白表达差异有显著性,芪棱汤组nestin蛋白表达明显高于其他各组。结论芪棱汤可以促进nestin蛋白表达,从而对缺血再灌注所导致的脑损伤起保护作用。

营养不良对仔鼠胰岛素和nestin蛋白水平的影响

目的连续观察营养不良仔鼠生后血糖、血清胰岛素的水平,并检测其胰腺组织中insulin(胰岛素)和nestin(巢蛋白)mRNA表达水平,探讨营养不良在仔鼠胰腺发育过程中的影响。方法用低蛋白饮食法低出生体重仔鼠的模型,实验组(R组)母鼠在21 d哺乳期继续低蛋白饮食喂养;对照组(C组)母鼠给予正常蛋白饮食喂养。仔鼠出生1、7、14、21 d采血监测血糖和血清胰岛素值;RTPCR检测胰岛素和nestin mRNA水平的表达。结果各时间点:1 R组仔鼠体重均低于C组;2血糖和血清胰岛素水平差异无统计学意义(P>0.05);3 R组胰腺中胰岛素和nestin mRNA水平均低于C组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论宫内营养不良可导致仔鼠低体重,生后早期其血糖和血清胰岛素水平虽然较对照组相比尚无改变,但胰腺中胰岛素含量已发生明显的改变,β细胞的再生减少可能是其机制。

rhG-CSF增加实验性脑缺血周围区的nestin蛋白表达

目的:研究重组人粒细胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte colony-stimulating factor,rhG-CSF)对大鼠局灶性脑缺血的神经元保护作用。方法:用线栓法建立大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型,于再灌注不同时间点对治疗组和对照组进行神经缺损评分(NSS);并用免疫组织化学方法测定神经上皮干细胞蛋白(nestin)的表达。结果:与对照组相比,rhC-CSF治疗组大鼠的神经缺损评分明显降低(P<0.05);治疗组脑梗死区周围的nestin表达较对照组增多。结论:脑缺血再灌注后,一定剂量rhG-CSF可能通过提高nestin的表达,增加神经细胞的修复,改善脑卒中的预后。

深低温停循环对大鼠大脑信号转导分子4和Nestin蛋白表达的影响

目的探讨深低温停循环对大鼠大脑信号转导分子4(brain signal transduction molecule 4,Smad4)和Nestin蛋白表达的影响。方法 45只SD大鼠随机分为深低温停循环组、常温停循环组和常温不停循环组各15只,建立体外循环后3组大鼠肛温分别控制在<20.0℃、36.5~37.0℃、36.5~37.0℃,深低温停循环组和常温停循环组大鼠体外循环10min后停循环10min,常温不停循环组大鼠体外循环20min后处死大鼠取额顶叶皮质脑组织行组织病理学HE染色,采用Western blot法检测大鼠脑组织Smad4和Nestin蛋白表达情况。结果常温停循环组大鼠大脑呈轻度缺血性改变,深低温停循环组和常温不停循环组大鼠大脑椎体细胞核仁清楚,呈椭圆形;深低温停循环组大鼠脑组织中Smad4和Nestin呈高水平表达,常温停循环组大鼠脑组织中Smad4和Nestin呈中等水平表达,常温不停循环组大鼠脑组织中Smad4和Nestin呈少量表达;深低温停循环组大鼠大脑组织Smad4(105.23±8.04)和Nestin(103.98±4.16)平均灰度值明显低于常温停循环组(118.38±7.24、120.52±6.73)和常温不停循环组(136.85±5.78、140.41±6.27)(P<0.05),常温停循环组明显低于常温不停循环组(P<0.05)。结论停循环可上调大鼠脑组织中Smad4和Nestin的表达水平,深低温可进一步促进停循环脑组织中Smad4和Nestin的表达水平。

成年大鼠液压冲击脑损伤诱导室下区Nestin和GFAP的表达

目的 应用免疫组织化学和免疫荧光双标技术结合激光共聚焦显微镜 ,观察脑损伤后不同时期室下区巢蛋白(Nestin)和胶质酸性纤维蛋白 (GFAP)的表达及其细胞类型。方法 用动液压冲击法建立动物模型 ,用LeicaQ5 0 0IW图像处理系统及免疫组化和免疫荧光双标法分析和显示不同时期 (1、3、5d ,1、2、3、4、6、8周 )Nestin和GFAP的表达变化。结果 损伤 2 4h后 ,室下区有大量Nestin和GFAP的表达 ,且激光共聚焦显微镜观察到有Nestin阳性突起与GFAP共存现象 ,7d左右达到高峰 ,然后随着时间的推移其表达逐渐下降。正常组和假手术组 ,室下区也可见到Nestin和GFAP的表达 ,但与脑损伤组相比较低 (P <0 .0 5 )。结论 脑损伤可诱导室下区Nestin和GFAP的表达 ,Nestin阳性突起与GFAP共存细胞可能具有干细胞特性 ,与神经元的修复有关。

清脑益元汤对大鼠脑缺血损伤Nestin、NGF表达的影响

目的研究清脑益元汤对大鼠脑缺血损伤后巢蛋白(Nestin)、神经生长因子(NGF)表达的影响,探究清脑益元汤对缺血性脑损伤神经元保护作用的部分机制。方法将192只健康SD大鼠随机分为两大组,每大组再分为4个亚组:空白组(n=6)、假手术组(n=30)、模型组(n=30)、清脑益元汤组(n=30)。采用改良的Longa线栓法制备大鼠急性脑缺血损伤模型,除空白组外,假手术组、模型组及清脑益元组按缺血损伤后1 d、3 d、7 d、14 d、28 d 5个取材时间点分为5个亚组。造模成功后取大鼠缺血侧脑组织,采用免疫组化法检测大鼠缺血侧皮质区Nestin、NGF表达,采用实时荧光定量PCR(Real-Time PCR)法检测大鼠缺血侧皮质区Nestin、NGF mRNA表达。结果(1)免疫组化法:与假手术组相比,模型组、清脑益元组在缺血侧Nestin、NGF阳性细胞明显增多(P<0.01,P<0.01);与模型组相比,清脑益元组Nestin、NGF阳性细胞表达明显增多(P<0.01,P<0.05);(2)Real-Time PCR法:与假手术组相比,模型组、清脑益元汤组大鼠脑组织缺血侧皮质区Nestin、NGF mRNA表达量增加(P<0.01,P<0.01);与模型组相比,清脑益元汤组大鼠脑组织缺血侧皮质区Nestin、NGF mRNA表达量升高(P<0.01,P<0.05)。结论清脑益元汤可能通过上调脑缺血损伤后Nestin、NGF蛋白及mRNA表达,促进脑组织损伤修复、保护神经元,进而发挥脑保护的作用。

巢蛋白阳性星形胶质细胞与癫痫持续状态后海马区胶质瘢痕形成的相关性研究

目的了解癫痫持续状态(SE)后7 d海马各区巢蛋白(nestin)阳性星形胶质细胞表达及数目的变化,探讨其与SE导致海马区胶质瘢痕形成的关系。方法SD大鼠随机分为SE组和对照组,应用匹罗卡品建立SE大鼠模型;在SE后7 d处死大鼠行盲法免疫荧光组化实验,观察大鼠海马各区nestin与胶质纤维酸性蛋白单克隆抗体(GFAP)阳性细胞形态与数目变化及两者共标重叠情况,并进行统计学分析。结果SE组大鼠在给予匹罗卡品后均出现Ⅳ级以上持续状态癫痫发作。SE后7 d:SE组大鼠海马nestin阳性细胞数目显著增加,且广泛分布于海马各区,并与GFAP阳性细胞大量共标重叠;而对照组大鼠海马nestin染色阳性细胞只少量出现在海马齿状回颗粒层,与GFAP阳性细胞无共标重叠。结论SE后海马区大量表达的星形胶质细胞样nestin免疫阳性细胞可能是未分化成熟的星形胶质细胞,具有胚胎细胞的特性,可能与SE后海马区胶质瘢痕形成有关。

脑肿瘤干细胞的研究现状

背景:在脑肿瘤中存在一种具有自我更新、无限增殖与多向分化能力的细胞,即脑肿瘤干细胞。脑肿瘤干细胞被认为是脑肿瘤发生、发展、转移与复发的根源。目的:总结和探讨脑肿瘤干细胞的研究现状。方法:以"脑肿瘤、脑肿瘤干细胞"为检索词,应该计算机检索Pubmed数据库1977-01/2011-07的相关文章,并查阅与干细胞及脑肿瘤干细胞实验有关的书籍,对资料进行初审,选取符合要求的有关文章共32篇。结果与结论:在恶性脑肿瘤中存在脑肿瘤干细胞。脑肿瘤干细胞是恶性脑肿瘤发生、发展、转移及复发的根源,其表达特异性的CD133、Nestin蛋白和ABC转运体。目前已经获得了分离脑肿瘤干细胞的简便方法。CD133阳性的肿瘤干细胞所占的比例与脑肿瘤的恶性程度呈正相关,可作为预后诊断指标之一。

成人眼小梁网内皮细胞具有干细胞/祖细胞的属性

背景:干细胞/祖细胞的研究为干细胞治疗疾病提供了可能,寻找正常人眼内小梁网干细胞/祖细胞,探究小梁网干细胞的属性能为原发性开角型青光眼的干细胞/祖细胞治疗提供新的思路。目的:探索小梁网内皮干细胞/祖细胞的属性。方法:选取成人眼球20例,其中10例眼球标本来源于因急性外伤大失血死亡后摘除的眼球,眶内容物剜除的眼球7例,3例来源于眼后段黑色素瘤患者手术摘除眼球。所有标本行苏木精-伊红染色以及免疫组化染色观察。结果与结论:小梁网内皮细胞中阳性表达nestin,阴性表达凝血因子Ⅷ,CD31和CD34,而角膜内皮细胞中弱阳性表达nestin,Schlemm管内皮细胞未见nestin阳性表达,但凝血因子Ⅷ,CD31,CD34均呈强阳性表达。表明小梁网内皮细胞均具有干细胞/祖细胞的属性,小梁网nestin蛋白阳性的内皮细胞相似于表达nestin的血管内皮祖细胞。

16Hz次声作用对大鼠海马神经干细胞增殖能力的影响

目的研究16Hz次声作用对大鼠海马神经干细胞增殖能力的影响。方法将72只SD大鼠随机分为16Hz,130dB次声作用组(n=24)、16Hz,90dB次声作用组(n=24)以及对照组(n=24)。次声作用组大鼠暴露于16Hz,130dB和90dB的次声压力仓系统,2h/d,分别作用1d、7d、14d、21d。取脑进行巢蛋白(nestin)免疫组化染色,观察大鼠海马nestin标记的神经干细胞的变化情况。结果130dB组从作用1d开始,大鼠海马中nestin阳性细胞数量开始增加;随着作用次数增加而增多,于14d达到高峰,21d下降,但仍然高于对照组。90dB组大鼠各时间点nestin表达均比130dB组弱(P<0.05)。结论16Hz次声作用所致的脑损伤能刺激大鼠海马神经干细胞增殖,从而参与受损神经的修复过程。

醒脑通络片对脑缺血损伤大鼠内源性神经干细胞的影响

目的观察醒脑通络片（黄芪、川芎、桃仁、红花、鸡血藤等）对脑缺血损伤大鼠内源性神经干细胞的影响。方法将120只SD大鼠随机分为假手术组和模型组（生理盐水灌胃）,醒脑通络片小、中、大剂量组5组,每组各24只,采用线栓法致大鼠脑缺血再灌注损伤模型。脑缺血再灌注后3、7、14、28 d时,神经功能评分后处死动物,用免疫组化法观察缺血侧海马溴脱氧尿嘧啶核苷（Brd U）、巢蛋白（Nestin）的表达。结果假手术组海马区仅有少量Brd U、Nestin阳性细胞表达,模型组及醒脑通络片各组再灌注3 d后Brd U、Nestin阳性细胞表达开始增多,7~14 d达高峰,28 d明显下降。和模型组比较,醒脑通络片各组Brd U、Nestin阳性细胞明显增多（P〈0.05或0.01）。醒脑通络片各组在再灌注14和28 d神经功能均显示恢复,和模型组比较有显著性意义（P〈0.05或0.01）。结论醒脑通络片可以促进内源性神经干细胞增殖、分化,可能为其治疗缺血性脑血管病的机制之一。

大鼠中脑神经前体细胞的分离鉴定和培养

目的确认从E14.5SD大鼠中脑胚胎分离的细胞符合神经前体细胞特性,并在体外建立合适培养体系使神经前体细胞能够长期生长及传代。方法分离E14.5SD大鼠胚胎中脑腹侧组织细胞,在体外含有碱性纤维细胞生长因子(bFGF)的无血清培养液内种植并传代,行nestin免疫学检查,并在分化前后行神经元特异性烯醇化酶(NSE)和胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)免疫学检查,同时做BrdU增殖实验。结果体外种植中脑神经细胞可以生长、分裂并长期传代,nestin染色及BrdU增殖实验为阳性,NSE和GFAP 在分化前阴性,而分化后为阳性。结论E14.5SD大鼠胚胎中脑分离的细胞符合神经前体细胞特性,并可在本实验所采用的培养液内长期生长、分裂和传代。

电针对AD大鼠学习记忆及神经干细胞表达的影响

目的：探讨电针对老年痴呆大鼠学习记忆功能和神经干细胞的巢蛋白（Nestin）、碱性成纤维细胞生长因子 （bFGF）表达的影响。方法：成年Wistar雄性大鼠随机分为正常组、模型对照组、模型组、西药组、电针组,每组12只。链脲霉素（STZ）注射法造大鼠AD模型.电针治疗三个疗程。Morris水迷宫测试大鼠学习记忆能力,免疫组化检测Nestin和bFGF表达。结果：定位航行试验显示,平均逃避潜伏期比较,AD模型组明显长于正常组、模型对照组，治疗后西药组、电针组有提高（P〈0.05, .电针组大鼠海马的Nestin和bFGF）阳性细胞数目最多，与模型组相比，差异具有显著性（P〈0.05）。结论：电针能够显著增强痴呆大鼠学习记忆功能, 修复AD大鼠的神经缺损，实现神经的保护效应。

不同厚度神经球冰冻切片免疫荧光细胞化学染色结果的比较

目的探索适合免疫荧光细胞化学染色的神经球最佳冰冻切片厚度。方法选取悬浮培养10～12 d的神经球,制作厚度分别为4、7、10μm的冰冻切片。采用免疫荧光细胞化学染色比较神经球神经上皮干细胞蛋白(nestin)的表达和定位。结果培养10～12 d的神经球直径为200～250μm,状态良好,折光性强,呈圆球状,周边有毛刺。4μm的神经球冰冻切片制作较难,容易卷片,但细胞层次清楚,染色均匀,密疏适宜,可较清楚计数细胞。成像清楚。胞核清晰,可见较多nestin染色阳性的完整胞质包绕4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色阳性的胞核,能观察更多的细胞间细节。7μm切片较4μm切片制作容易,切片较平整,细胞层次不如4μm切片清楚,染色较均匀。所含细胞数较4μm多,可粗略计算细胞数。荧光拍照不能完全对焦,可见部分完整细胞形态。10μm的冰冻切片制作相对容易,切片平整,但细胞层次不清楚,堆叠严重,成像不清楚,难以看到完整细胞形态。结论 4μm厚度的神经球冰冻切片较适合进行免疫荧光细胞化学染色和分析。

体外三步法诱导胚胎干细胞定向生成神经干细胞的实验研究

目的探讨体外定向诱导胚胎干细胞(embryonicstemcells,ESCs)生成高纯度神经干细胞(neuralstemcells,NSCs)的方法。方法模拟体内神经细胞分化发育的不同阶段及微环境,以脑星形胶质细胞为支持细胞,用全反式维甲酸(All-transretinoicacid,ATRA)等分三阶段诱导ESCs定向生成NSCs。形态学观察及畸胎瘤形成试验对ESCs的全能性进行鉴定;形态学观察结合免疫组织化学、流式细胞术和RT-PCR检测胚胎干细胞标志OCT-4和神经干细胞标志Nestin蛋白和(或)基因表达对诱导全过程进行动态监测;NSCs分化试验对所诱导的NSCs的分化潜能进行检测。结果⑴体外培养的小鼠ESC-D3细胞在胚胎成纤维饲养层细胞上连续传代培养,仍保持向三胚层分化的能力;⑵随着诱导的进行,OCT-4表达逐渐减弱并消失,而Nestin表达逐渐增强,经三步法最终可诱导形成纯度高达90%以上的Nestin阳性细胞;⑶所诱导生成的细胞在NSCs选择性培养基中反复传代,仍表现为Nestin阳性和具有生成神经球的能力,在含血清培养基中可进一步分化为神经元、星形神经胶质细胞和少突胶质细胞。结论采用星形胶质细胞作为诱导基质,模拟体内神经分化过程的三步诱导法,可诱导ESCs生成较高纯度的NSCs,并能较好维持其干细胞特性和具有进一步分化的能力。

安寐丹对睡眠剥夺大鼠海马CA1区细胞结构及神经元损伤的保护作用

目的:探讨安寐丹对睡眠剥夺大鼠海马神经元及相关蛋白表达的影响。方法:通过随机数字表法将SD大鼠分为空白组、模型组、安寐丹组和褪黑素组。空白与模型组给予等容生理盐水,安寐丹组给药9.09 g·kg^(-1)·d^(-1)。褪黑素组给药0.27 g·kg^(-1)·d^(-1)。自制睡眠剥夺箱造模4周。Ethovision XT视频分析系统监测大鼠自发活动状态,苏木素-伊红(HE)染色观察海马CA1区神经元形态,尼氏染色观察海马CA1区神经元及尼氏体变化,超微电镜观察海马细胞超微结构,免疫组化检测海马CA1区胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、微管相关蛋白2(MAP2)、巢蛋白(Nestin)、神经元特异核蛋白(NeuN)的表达。结果:与空白组比较,模型组中心点移动距离延长,平均活动速度增加,中心点累计持续时间增加,身体填充平均值增加,活动频率更高(P<0.01),海马CA1区神经元数量减少,排列紊乱,核皱缩,细胞质深染,尼氏体数量减少,出现明显丢失,线粒体出现肿胀变形,嵴缩短,高尔基体囊泡肿胀,GFAP蛋白积分吸光度(IA)增加,MAP2、Nestin、NeuN蛋白IA下降(P<0.01);与模型组比较,安寐丹组中心点移动距离缩短,平均活动速度降低,中心点累计持续时间缩短,身体填充平均值降低,活动频率降低(P<0.05,P<0.01),海马CA1神经元损伤减轻,细胞数量增加,核仁清晰,胞浆明显,尼氏体数量增加,线粒体等细胞器损伤减轻,GFAP蛋白IA降低,MAP2、Nestin、NeuN蛋白IA升高(P<0.05,P<0.01)。结论:安寐丹改善睡眠剥夺大鼠海马CA1神经元结构损伤,并可能通过降低GFAP蛋白表达,增加MAP2、Nestin、NeuN蛋白表达而实现。