电针对小鼠脑缺血后Neurogenin2表达和神经功能的影响

目的:探讨电针刺激百会穴对成年小鼠脑缺血损伤后Neurogenin2(Neurog2)的表达和神经功能的影响。方法:成年雄性C57BL/6J小鼠,随机分成4组,对照组,电针+对照组,缺血组,电针+缺血组。结扎双侧颈总动脉构建全脑缺血模型(20 min)。电针组于建模后24 h后连续电针刺激百会穴5 d,采用Real-time PCR方法,检测脑组织中Neurog2 mRNA的表达情况,并且应用total motor scores(TMS)法评估神经功能,分析电针刺激7 d后Neurog2的表达对脑缺血小鼠神经认知的影响。结果:Neurog2基因在脑缺血后3 d表达逐渐增加,5 d最高,7d开始下降,给予电针治疗后,Neurog2的表达较缺血组明显增加,而且电针组的神经行为学评分中也优于缺血组(P<0.05)。结论:脑缺血激活Neurog2基因表达,电针可促进Neurog2表达增加,改善神经功能,这可能是电针治疗脑缺血再灌注损伤的新机制。

Neurogenin2基因调控许旺细胞转分化为神经元

背景:Neurogenin2(Ngn2)基因调控星形胶质细胞分化为神经元已被实验证实,这提示许旺细胞也可能通过基因调控分化为神经元。目的:研究Neurogenin2基因调控大鼠许旺细胞向神经元分化的可行性。方法:体外培养、纯化及鉴定大鼠许旺细胞,然后用含绿色荧光蛋白基因的慢病毒载体系统将Neurogenin2基因转染导入许旺细胞中,最后用含碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和脑源性细胞生长因子的无血清DMEM诱导培养许旺细胞2周。显微镜观察细胞形态,免疫细胞化学检测髓磷脂碱性蛋白及神经元特异性烯醇化酶。结果与结论:许旺细胞转染导入Neurogenin2基因并诱导分化后,免疫荧光检测发现12.56%的细胞表达神经元标志性蛋白神经元特异性烯醇化酶,而对照组均未发现表达神经元标志性蛋白神经元特异性烯醇化酶。Neurogenin2基因植入可使大鼠许旺细胞表达神经元标志性蛋白神经元特异性烯醇化酶,提示该基因可调控许旺细胞转分化为神经元。

Neurogenin2与小鼠齿状回中神经元的生成

目的:观察幼年及成年小鼠海马齿状回中Neurogenin2(Ngn2)的表达,通过比较新生及成年小鼠神经元生成水平与Ngn2的表达,初步分析其对成年神经元生成的影响。方法:将C57BL/6雄性小鼠分为幼年组(7d)和成年组(4月),每组6只。两组小鼠均接受腹腔注射Bromodeoxyuridine(Brdu)3d,2次/d,于最后一次注射后2h进行灌注、取脑、包埋标本。采用免疫荧光技术对Ngn2、Brdu、Doublecortin(DCX)、NeuN染色并进行细胞计数,初步分析Brdu、Ngn2双阳性细胞的细胞类型及表达水平。结果:(1)Ngn2阳性细胞主要分布于齿状回颗粒细胞下层;并且大部分Ngn2阳性细胞同时表达Brdu;(2)幼年组Ngn2+/Brdu+细胞数量明显多于成年组,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:Ngn2主要表达于分裂状态下的神经前体细胞,其表达与神经再生水平呈正相关。由此可以认为,在神经元生成过程中,Ngn2亦对神经前体细胞向神经元分化起着重要作用。

皮肤源性再程序化神经干细胞的制备以及定向分化为神经细胞的体外研究

目的:研究制备皮肤源性再程序化神经干细胞以及诱导其定向分化为神经细胞的可行性。方法:体外培养大鼠皮肤来源前体细胞(skin-derived precursors,SKPs)并纯化、鉴定,用含有绿色荧光蛋白(GFP)基因的慢病毒载体系统作为基因转染工具,将第3代SKPs分3组:A组为慢病毒载体介导neurogenin2(Ngn2)基因转染的SKPs;B组为空载体慢病毒转染的SKPs;C组为未进行慢病毒介导基因转染的SKPs;7天后加入无生长因子含10%胎牛血清的诱导培养基诱导7天。光镜下观察比较各组细胞形态变化以及免疫荧光镜下研究各组SKPs诱导后定向分化为神经细胞的差异。结果:A组SKPs转基因后到第7天绿色荧光达到高峰,并可持续稳定表达绿色荧光至第8代;诱导7天后绝大部分细胞类似神经细胞,胞体呈梭形或椭圆形,有多个突起伸出;免疫荧光结果显示90.98%细胞表达微管相关蛋白-2(MAP-2),62.23%细胞表达神经元特异性蛋白NeuN。B组SKPs在空病毒转染7天以后有绿色荧光;诱导7天以后大多数细胞较诱导前无明显变化;免疫荧光结果显示,有34.35%的细胞表达MAP-2,无神经元特异性蛋白NeuN的表达。C组SKPs无绿色荧光;诱导7天以后大多数细胞较诱导前无明显变化;免疫荧光结果显示,29.54%的细胞表达MAP-2,无神经元特异性蛋白NeuN的表达。结论:慢病毒介导Ngn2基因转染SKPs可以制备出皮肤源性再程序化的神经干细胞,并提高其定向分化为神经细胞的能力。

再程序化星形胶质细胞的制备及体外定向分化为神经元的研究

目的探讨再程序化星形胶质细胞制备并在体外诱导其分化为神经元。方法在体外培养大鼠脑皮质来源星形胶质细胞(astrocyte),随后将提纯、鉴定过的第三代星形胶质细胞接种于12孔培养皿中,并分为A、B、C 3组。其中A组为带有绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒载体介导neurogenin2(Ngn2)基因转染的星形胶质细胞,制备再程序化星形胶质细胞;B组为带有GFP基因的空载体病毒转染的星形胶质细胞;C组为未进行慢病毒介导基因转染的星形胶质细胞;转基因1周后加入含细胞生长因子诱导培养基诱导分化15 d,光镜下观察各组细胞形态变化以及定向神经元分化的差异。结果 A组星形胶质细胞转基因后再诱导15 d,很大部分细胞形态呈神经元样改变,胞体呈梭形或椭圆形,有多个突起伸出且突起较长,表达神经元核蛋白(Neu N)、神经丝蛋白(NF)及神经元特异性烯醇化酶(NSE)的比例大大提高,相比B组及C组,差异有统计学意义(均P<0.05);而B组与C组神经元分化比例的差异无统计学意义(P>0.05)。结论慢病毒介导Ngn2基因体外转染星形胶质细胞可制备出再程序化星形胶质细胞,诱导后具有更强的向神经元定向分化能力。

Ngn2和Math6在小鼠内耳不同时期表达的初步研究

目的研究neurogenin2(ngn2)和math6在不同时期小鼠内耳的表达变化,并初步探讨其对螺旋神经元发育的调控作用。方法本实验选取不同时期健康的BALB/c小鼠,以E12.5、E13.5、E14.5、E17.5、P1、P7和成年为观察时间点,应用real-time PCR、免疫组织化学方法检测ngn2、math6在耳蜗中mRNA和蛋白的表达。结果 (1)re al-time PCR结果提示ngn2在E12.5d呈高表达,随后在E13.5d表达量下调,直至成年呈低水平表达;math6在E12.5-P1都呈较高水平表达,其中在P1达到高峰,随后于P7至成年表达量下调。(2)免疫组织化学结果提示,在E13.5、E14.5和P1,ngn2和math6在螺旋神经节处(或螺旋神经元细胞核处)有不同程度的阳性表达;在成年期,math6在细胞核有弱表达,但ngn2几乎不表达,各组间差异有统计学意义(P<0.05)。结论 (1)ngn2在E12.5d表达呈高峰,提示其在有增殖能力的神经祖细胞中起作用;math6在E12.5d-P1呈高表达,提示其在神经祖细胞的增殖以及分化中其起重要作用;(2)ngn2和math6在耳蜗中表达的空间和时间模式的重叠和差异,提示它们在调控通路中可能受到共同的分子调控。

Ngn2促进皮肤干细胞神经分化的电生理学及其机制研究

目的:探讨Ngn2基因转染皮肤干细胞(SKPs)促进神经分化的电生理学机制及可能的机制。方法:体外培养SD大鼠乳鼠SKPs并纯化、鉴定。构建包装含Ngn2基因并用绿色荧光蛋白(GFP)标记的病毒载体。将SKPs分3组:Ngn2组为包装有Ngn2基因的慢病毒转染的SKps,空病毒组为未包装任何基因的慢病毒转染的SKps,空白对照组为未经慢病毒转染的SKps,各组6皿。诱导液诱导14 d,全细胞膜片钳技术检测各组SKPs的电生理活动;Wetern Blot检测各组SKps钠离子通道相关蛋白Nav1.3及Notch信号通路相关蛋白Hes1和Dll1表达水平。结果:诱导14 d后,Ngn2组SKPs出现电压依赖性钠离子通道电流,而其他2组SKPs均未引出钠离子通道电流;Ngn2组SKPs的Nav1.3蛋白表达水平高于其他2组(P<0.01);Ngn2组SKPs Dll1蛋白的表达水平高于其他2组,Hes1蛋白的表达水平低于其他2组(P<0.01)。结论:Ngn2基因促使SKPs表达电压门控性钠离子通道,其机制可能与Notch信号通路有关。

局部转染Ngn2基因对大鼠实验性急性脊髓损伤运动功能影响的研究

目的:研究局部转染Ngn2基因对急性脊髓损伤大鼠运动功能的影响。方法:将36只4月龄SPF级SD大鼠,随机分成3组,分别为A组(假手术组)、B组(实验组)、C组(对照组),每组12只。假手术组只咬除T8~T10棘突及椎板、不损伤脊髓,实验组和对照组采用改良Allen's打击法制造T8急性脊髓损伤模型,术后分别向B、C 2组损伤脊髓节段持续注射Ngn2质粒和空载体质粒各5μg。于术后1、2、3、4周采用BBB运动功能评分系统检测大鼠运动功能,术后1周应用RT-PCR检测损伤节段脊髓组织Ngn2基因表达,术后4周HE染色脊髓病理学检测及SP染色检测Nestin+细胞数。结果:术后各时间点实验组BBB评分明显优于对照组,有统计学意义(P<0.05);实验组大鼠脊髓组织中Ngn2mRNA有表达,而对照组无表达;实验组单个视野Nestin+细胞为(14.25±2.37)个,对照组单个视野Nestin+细胞为(2.54±1.14)个,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:Ngn2基因能够促进急性脊髓损伤大鼠运动功能恢复,可能与诱导脊髓内源性神经干细胞的增殖有关。

大鼠Ngn2基因真核表达质粒的构建

目的：构建大鼠Neurogenin2（Ngn2）基因的真核表达质粒。方法：从大鼠海马组织提取海马总mRNA ，RT-PCR获得Ngn2基因cDNA，构建重组质粒pSecTag2／HygroB-Ngn2， XhoⅠ和HindⅢ双酶切、测序鉴定重组质粒。结果：RT-PCR获得片断与预期结果相符，酶切鉴定、测序鉴定证实pSecTag2／HygroB-Ngn2重组质粒构建成功。结论：成功构建了大鼠Ngn2基因的真核表达质粒，并对该基因的真核表达产物进行鉴定，为下一步Ngn2基因对神经损伤修复作用的研究奠定基础。

Ngn2基因诱导的神经潜能骨髓间充质干细胞移植联合Janus激酶信号转导及转录激活因子通路抑制剂治疗大鼠脑缺血

目的观察Ngn2基因(Ngn2)诱导的神经潜能骨髓间充质干细胞(MSCs)和Janus激酶信号转导及转录激活因子(JAK-STAT)信号通路抑制剂AG490联合移植对大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤的神经保护作用。方法体外培养MSCs(南京医科大学药学院实验室培养)并将Ngn2基因转染MSCs,细胞免疫荧光观察基因转染后神经细胞标记蛋白表达情况。制备大鼠大脑中动脉栓塞(MCAO)模型。100只SD大鼠按照随机数字表达分为5组,分别设为Sham组,1%二甲基亚砜(DMSO)组、AG490组、Ngn2-MSCs+1%DMSO移植组、Ngn2-MSCs+AG490移植组。移植治疗24 h后原位缺口末端标记法(TUNEL)法检测大鼠脑缺血区细胞凋亡水平。分别于3、7、14 d对每组大鼠进行神经缺陷症状评分,14 d后处死动物,氯化三苯四唑(TTC)法染色后计算脑梗死体积,干湿重法称量脑含水量。结果 Ngn2转染MSCs后,Ngn2-MSCs细胞表现出向神经细胞分化的潜能,Ngn2-MSCs联合AG490移植治疗组中大鼠脑缺血区细胞凋亡水平(16.2±5.6,F=197.53,P<0.01)、脑梗死体积[(12.31±6.24)%,F=35.92,P<0.01]及脑含水量[(77.55±0.53)%,F=56.18,P<0.01]较其他各组明显降低,神经缺陷评分在移植后7 d较其他各组开始降低(3.31±0.46,F=14.47,P<0.01),移植治疗14 d后评分显著较其他组降低(1.63±0.35,F=22.71,P<0.01)。结论 Ngn2-MSCs联合AG490移植疗法对脑缺血再灌注损伤有明显协同神经保护作用。