NRP-1在胃癌组织及细胞系中的表达及临床意义

目的研究神经纤毛蛋白1(NRP-1)在胃癌组织的表达,探讨其与胃癌发生、发展及临床病理因素的关系及可能的临床意义。方法应用免疫组织化学染色检测180例胃癌患者的胃癌组织及癌旁组织标本NRP-1表达,用免疫印迹方法检测胃癌组织及不同分化程度的胃癌细胞NRP-1表达,K-M生存曲线和多因素回归模型用于分析胃癌预后。结果胃癌组织中NRP-1表达水平明显高于癌旁组织(P<0.001),胃癌组织中NRP-1高表达与肿瘤分化程度、淋巴结转移、AJCC分期、T分期呈正相关(P<0.05)。多因素生存分析表明高表达NRP-1是胃癌患者总生存期的独立预后因子。结论过表达NRP-1可能在胃癌进展中发挥着重要作用,过表达NRP-1可作为生物标志物预测胃癌患者的不良预后。

大肠癌组织中Neuropilin-1的表达及其与肿瘤血管生成的相关性研究

目的:检测大肠癌组织中神经纤毛蛋白-1(Neuropilin-1,NRP-1)mRNA的表达情况及微血管密度(MVD)值,探讨NRP-1mRNA的表达与MVD间的相关性,以期了解NRP-1与肿瘤血管生成的关系。方法:取45例大肠癌组织及相应正常大肠组织,采用半定量RT-PCR方法检测其NRP-1mRNA的表达情况,采用免疫组化染色法检测CD105标记的新生肿瘤血管,计数MVD值。结果:45例大肠癌组织中39例可见NRP-1mRNA的表达,阳性率为87.0%;相应正常大肠组织仅3例表达,阳性率为6.7%。大肠癌组织中NRP-1mRNA的表达程度与肿瘤的大小、浸润的深度、淋巴结转移呈正相关(P<0.05),与肿瘤部位、组织学类型、分化程度、患者的性别及年龄无关(P>0.05)。大肠癌组织中NRP-1mRNA的表达程度随MVD值的增加而升高(r=0.38,P=0.01)。结论:NRP-1可能与大肠癌的肿瘤血管生成相关,NRP-1mRNA高表达代表着大肠癌不良的生物学行为趋向。

大肠癌组织中NRP-2、NRP-1的表达及其与肿瘤淋巴结转移的相关性研究

目的检测大肠癌组织中NRP-2、NRP-1的表达情况,探讨NRP-2、NRP-1的表达与大肠癌淋巴结转移的关系,以期揭示NRP-2与NRP-1在大肠癌发生和发展过程中的作用。方法采用免疫组化法检测55例大肠癌患者大肠癌组织、癌旁组织中NRP-2、NRP-1的表达情况,并分析NRP-2、NRP-1的表达与大肠癌淋巴结转移的相关性。结果 (1)大肠癌组织中NRP-2的阳性表达率为81.8%,癌旁组织中的阳性表达率为14.5%,差异有统计学意义(χ2=58.49,P<0.01);大肠癌组织中NRP-2高表达组的淋巴结转移阳性例数显著多于NRP-2低表达组(χ2=10.69,P<0.01)。(2)大肠癌组织中NRP-1的阳性表达率为70.9%,癌旁组织中的阳性表达率为25.5%,差异有统计学意义(χ2=22.76,P<0.01);大肠癌组织中NRP-1高表达组的淋巴结转移阳性例数显著多于NRP-1低表达组(χ2=7.73,P<0.01)。(3)大肠癌组织中NRP-2、NRP-1均为高表达的患者淋巴结转移率显著高于均为低表达者(χ2=10.76,P<0.01)。结论 NRP-2、NRP-1的表达可能与大肠癌的发生和发展密切相关,并且可能有协同作用。

siRNA靶向NRP-1基因沉默经Wnt、ROS及TGF-β1途径抑制宫颈癌细胞增殖

目的:探讨RNA干扰神经纤毛蛋白1(NRP-1)基因对宫颈癌细胞凋亡、ROS水平及免疫分子表达的影响。方法:以人正常宫颈细胞Ect1/E6E7为对照细胞,Western blot检测宫颈癌Hela、Ca Ski、Si Ha、HCC94细胞NRP-1的蛋白表达;通过Lipofectamine^(TM)2000将NRP-1-siRNA瞬时转染Ca Ski细胞,并设置阴性对照组(NC-siRNA)和空白对照组(Control组),转染48 h后,CCK8法检测各组细胞活力;流式细胞仪检测各组细胞凋亡率及ROS含量; Western blot检测免疫抑制因子TGF-β1及Wnt信号通路相关蛋白Wnt1、β-catenin、Survivin和Cyclin D1的蛋白表达。结果:宫颈癌细胞中NRP-1的表达均显著高于在Ect1/E6E7细胞中的表达(P<0. 05);转染NRP-1-siRNA的Ca Ski细胞NRP-1的蛋白表达显著低于对照组(P<0. 05);与对照组比较,NRP-1-siRNA组细胞活力显著降低,细胞凋亡率及ROS含量均显著升高,TGF-β1、Wnt1、β-catenin、Survivin和Cyclin D1的蛋白表达均显著降低(P<0. 05)。结论:抑制宫颈癌中NRP-1基因表达可降低癌细胞活力,诱导细胞凋亡,降低免疫抑制分子TGF-β1表达,其机制与提高细胞ROS水平和下调Wnt信号通路有关。

Neuropilin-1^＋ T细胞与CD4^＋ CD25^＋调节性T细胞的比较

目的:分析Neuropilin-1+T细胞(Nrp-1+T细胞)与经典CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)的关系并比较二者的免疫调节作用。方法:流式细胞术分析BALB/c小鼠脾脏T细胞上Nrp-1与CD4、CD25的表达关系并分选Nrp-1+T细胞及CD4+CD25+Treg,通过B16-F10-luc-G5黑色素肿瘤细胞体外培养实验并利用萤光成像系统,观察比较两种细胞对NK细胞杀伤B16-F10-luc-G5黑色素瘤细胞的影响。结果:CD4+CD25+Treg中表达Nrp-1的比例为(27.28±1.17)%,明显高于CD4+CD25-T细胞的(1.63±0.08)%(P<0.01);在体外实验中,Nrp-1+T细胞与CD4+CD25+Treg均能抑制NK细胞杀伤B16-F10-luc-G5黑色素瘤细胞,Nrp-1+T细胞组的肿瘤细胞数目在6、24、48、72h分别为984±15、1015±14、1261±21、1323±38,高于CD4+CD25+Treg组的931±4、983±8、1201±18、1256±18,两组肿瘤细胞数目在各时间点均有统计学意义(P<0.01)。结论:经典CD4+CD25+Treg中表达Nrp-1的细胞比例较高,Nrp-1+T细胞有负性免疫调节作用,抑制功能比CD4+CD25+Treg更强,可以作为一类新的Treg亚群。

Neuropilin-1 mRNA在不同动情周期及周龄阶段小鼠卵巢中的表达

目的:探讨Neuropilin-1(NRP-1)mRNA在繁殖适龄期小鼠动情周期间以及不同周龄阶段小鼠卵巢中的表达。方法:选用繁殖适龄期不同动情周期小鼠以及不同周龄阶段小鼠,通过实时定量聚合酶链反应检测其卵巢中NRP-1 mRNA的表达。结果:NRP-1在小鼠不同动情周期卵巢中的表达在mRNA水平差异无显著性(P>0.05)。比较其mRNA在不同周龄阶段小鼠卵巢的中表达显示,近绝育期32周组表达水平显著高于其他组:为3周组的2.94倍(P<0.01),6周组的4.92倍(P<0.01),11周组的2.29倍(P<0.01)。而其他各组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:NRP-1 mRNA在小鼠卵巢中的表达不随动情周期而改变,且随着卵巢生理功能的下降而显著升高,提示NRP-1与卵巢衰老进程有关。

NRP-1介导的非依赖VEGF-VEGFR2通路在肿瘤发生发展中的作用

神经纤毛蛋白(NRP)-1作为NRP家族中重要成员之一,常表达于内皮细胞及部分肿瘤细胞。近年来越来越多研究证实NRP-1主要通过VEGF-VEGFR2通路在肿瘤发生发展中起重要作用。除此之外,NRP-1还可以与其他生长因子及其受体结合,如血小板衍生生长因子(PDGF)及其受体。另外,最近有研究表明NRP-1通过NRP-1-ABL通路促进血管形成,而不依赖VEGF-VEGFR2。并且NRP-1-ABL和PDGF通路下游都涉及Rad51蛋白,而Rad51蛋白则是体内催化同源重组性DNA修复最主要的关键酶。Rad51过表达可使肿瘤细胞对放化疗产生耐受。抑制NRP-1也许可以弥补单纯抑制VEGF-VEGFR2通路在肿瘤治疗中的不足,为肿瘤的治疗提供新思路。因此本文就NRP-1不依赖VEGF-VEGFR2通路在肿瘤发生发展中的作用作一综述。

靶向Neuropilin-1的抗肿瘤研究进展

Neuropilin-1(NRP-1)又称神经鞭毛素蛋白,是一个大小为130～140 kD的非酪氨酸激酶跨膜蛋白,参与脊椎动物胚胎的神经和心血管系统发育。它作为一个多功能受体调节VEGF(血管内皮生长因子),PDGF(血小板衍生生长因子),bFGF(成纤维生长因子)等细胞因子的信号通路,与肿瘤血管新生和肿瘤转移密切相关。NRP-1被认为是一个新的肿瘤治疗靶点,近年来针对NRP-1为靶点的药物研究有不少新进展。本文主要介绍NRP-1的生物学特征,对肿瘤作用以及相关药物研究。

Neuropilin-1及其配体SemaphorinIII在AML和正常人骨髓中的表达初探

目的 :了解neuropilin_1基因及其配体semaphorinIII在急性髓性白血病 (AML)骨髓中的表达情况。方法 :利用逆转录_聚合酶链反应扩增20例急性髓性白血病病人骨髓单个核细胞中的neuropilin_1基因及其配体semaphorinIII基因 ,了解其表达情况。14例非血液病患者的骨髓标本作为对照。结果 :急性髓性白血病骨髓单个核细胞中的neuropilin_1基因表达率为15 0% ,semaphorinIII基因表达率为60 0% ,分别与相应正常对照(7 1 % ,57 1% )相比较无显著性差异。结论 :参与调控骨髓基质细胞的neuropilin_1基因及其配体semaphorinIII可表达于AML和正常人的骨髓细胞中 。

人参皂苷Rg3对子宫内膜异位症组织中ID-1和NRP-1基因表达的影响

目的探讨人参皂苷Rg3对子宫内膜异位症(EMs)组织中ID-1和NRP-1基因表达的影响。方法采用SuperArray功能分类基因芯片检测的方法筛选EMs血管生成相关基因,并用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法进行验证。结果促血管生成的ID-1和NRP-1基因在异位子宫内膜细胞中表达明显高于在位子宫内膜细胞及正常子宫内膜细胞(P<0.05);经人参皂苷Rg3作用后ID-1和NRP1基因在异位子宫内膜细胞中表达明显低于在位子宫内膜细胞及正常子宫内膜细胞(P<0.05)。结论人参皂苷Rg3有抑制子宫内膜异位细胞中ID-1和NRP1基因表达的作用,ID-1和NRP1基因可能在EMs血管生成中发挥重要作用。

Neuropilin-1的结构、功能及其在口腔癌中的研究进展

神经纤毛蛋白-1（Neuropilin-1,NRP-1）是一个大小120~130 ku的非酪氨酸激酶跨膜蛋白,具有独特的分子结构,可作为Ⅲ型信号素家族（Semaphorin3A,Sema3A）、血管内皮生长因子165（vascular endothelial growth factor165,VEGF165）、胎盘生长因子（placenta growth factor,PIGF）等细胞因子的多功能受体,并受miR-9、miR-124、miR-181b、miR-320等的靶向调节,参与上述细胞因子的信号通路,与肿瘤血管新生和转移密切相关。近年来,对NRP-1的研究已从最初的神经轴突导向扩展至血管生成、肿瘤增殖和转移、调节免疫等多方面。该文就NRP-1的结构、功能及在口腔癌中的研究进展作一简要综述。

Semaphorin 3A及其受体Neuropilin-1在舌癌组织及Tca8113中的表达

目的:观察Semaphorin 3A(SEMA3A)及其受体Neuropilin-1(Nrp-1)在舌癌组织及舌癌细胞系Tca8113中的表达,探讨其对舌癌中血管生成的意义。方法:应用免疫组织化学方法检测舌癌组织和癌旁组织中SEMA3A及Nrp-1的表达,应用免疫细胞化学检测SEMA3A及Nrp-1在Tca8113中的表达,并用Western印迹检测舌癌组织、癌旁组织及舌癌细胞系Tca8113中SEMA3A及其受体Nrp-1的表达情况。采用SPSS11.0软件包对数据进行χ2检验。结果:免疫组织化学显示,17/20例舌癌组织SEMA3A呈阴性表达,18例Nrp-1呈阳性表达。19/20例癌旁组织中SEMA3A阳性表达,而Nrp-1均呈阴性表达。免疫细胞化学显示,SEMA3A在舌癌细胞中检测不到,而Nrp-1均呈阳性表达。Western印迹检测与此结果完全相符。SEMA3A及Nrp-1在舌癌及癌旁组织中的表达有显著差异(P<0.001)。结论:SEMA3A及其受体Nrp-1在舌癌组织及细胞系中表达异常,提示其可能与肿瘤血管生成相关。

CD8^+CD28^-NRP-1^+T细胞在肾移植手术后患者外周血中的比例变化及意义

用流式细胞仪分别检测不同功能状态下肾移植术后患者体内的CD8^+CD28^-NRP-1^+Ts细胞和CD8^+CD28^-Foxp3^+Ts细胞,通过比较两类细胞的阳性表达率初步探讨它们之间的表达关系和意义。选取正常健康人10例,移植肾功能稳定的长期存活者24例,慢性移植物肾病者20例,急性排斥者15例,取受试者外周静脉血,分离单个核细胞,利用流式细胞仪检测CD8^+CD28^-NRP-1^+Ts细胞和CD8^+CD28^-Foxp3^+Ts细胞在CD8^+CD28^-T细胞群中的比例。结果表明组间比较得出,CD8^+CD28^-NRP-1^+Ts细胞和CD8^+CD28^-Foxp3^+Ts细胞比例在四组之间均有统计学差异(P<0.05)。其中在长期存活组表达量最高,其CD8^+CD28^-NRP-1^+Ts细胞和CD8^+CD28^-Foxp3^+Ts的比例分别为16.15%±1.49%和11.90%±2.73%,其次为正常健康人(13.83%±2.38%、9.44%±2.03%),然后为慢性移植物肾病组(8.03%±2.67%、5.26%±0.65%),而急排组最低(3.34%±1.73%、2.36%±1.14%),并且四组间这两种细胞呈同一变化趋势且前者的变化幅度大于后者。组内比较显示,CD8^+CD28^-NRP-1^+Ts细胞比例均高于CD8^+CD28^-Foxp3^+Ts细胞(P<0.05)。CD8^+CD28 NRP-1^+Ts细胞可以从整体水平上反映肾移植术后患者的免疫状态,它比CD8^+CD28^-Foxp3^+Ts细胞更能全面的反映术后患者的预后情况。

NRP-1单克隆抗体对乳腺癌裸鼠移植瘤生长的影响

目的探讨NRP-1单克隆抗体(NRP-1 MAb)的特异性,以及不同剂量的NRP-1 MAb治疗乳腺癌裸鼠移植瘤的疗效。方法 Western blot和共聚焦免疫荧光法检测NRP-1 MAb是否识别MCF7细胞上NRP-1蛋白。将MCF7细胞接种于BALB/c裸鼠皮下建立乳腺癌细胞移植瘤模型,并进行瘤组织传代。传代的肿瘤体积生长至300～500 mm^3时,随机分为对照组、NRP-1 MAb低剂量组、中剂量组和高剂量组,每组6只,给药7次。观察荷瘤裸鼠一般状况,测量瘤体大小及裸鼠体重。实验结束时剥离瘤体称重,提取组织蛋白,Western blot检测组织中VEGF蛋白和NRP-1蛋白的表达量。结果 NRP-1MAb成功识别MCF7细胞上的NRP-1蛋白;NRP-1 MAb能够有效抑制MCF7细胞裸鼠移植瘤的生长,低剂量组(1 mg/kg)抑瘤率为47.01%,中剂量组(5 mg/kg)抑瘤率为65.70%,高剂量组(10 mg/kg)抑瘤率为69.19%。结论 NRP-1 MAb能够识别并有效结合MCF7细胞膜上的NRP-1蛋白,且可抑制MCF7细胞移植瘤的生长,NRP-1 MAb抑制移植瘤的增长可能与下调NRP-1和VEGF表达有关。

大鼠弥漫性轴索损伤后突起坍塌蛋白Sema3A及其受体neuropilin-1的表达

目的研究突起坍塌蛋白(semaphorin 3A,Sema3A)及其受体神经纤毛蛋白1(neuropilin-1,NRP-1)在弥漫性轴索损伤(DAI)大鼠脑组织中的表达,探讨二者在DAI后脑损伤及神经修复中的可能作用及分子机制。方法健康成年雄性SD大鼠48只,随机分为4组:对照组、DAI后6h、24h、7d组,每组各12只。采用大鼠头颅瞬间旋转损伤装置,制作大鼠颅脑DAI模型,改良NSS法评估大鼠神经功能的改变。按预定时间点灌注取脑进行HE及镀银染色,免疫荧光染色检测Sema3A和NRP-1的表达定位。RT-PCR与Western blot分别检测皮质、海马、脑干Sema3A和NRP-1的mRNA及蛋白表达。结果 DAI造模后在脑干、皮髓交界区、胼胝体等部位观察到神经轴突有不同程度的肿胀、迂曲、断裂、轴索球形成等病理征象,并有不同程度的神经细胞变性、核固缩等改变,伤后24h最明显。免疫荧光显示Sema3A主要表达于各脑区神经元,NRP-1表达于神经元、星形胶质细胞及微血管内皮细胞。对照组Sema3A和NRP-1mRNA及蛋白表达水平较低,DAI后6h其表达显著升高,24h达高峰,并持续到7d。结论 Sema3A及其受体NRP-1在DAI大鼠脑组织内表达升高,参与神经损伤及修复的病理生理过程。

沉默NRP-1基因对人T细胞白血病Jurkat细胞株增殖与凋亡的影响

目的:探讨RNAi沉默NRP-1基因对人T细胞白血病细胞株增殖与凋亡的影响。方法:将我们前期构建好的p LB-NRP-1/shRNA重组慢病毒质粒,感染至Jurkat细胞中,用CCK-8法检测各组细胞的增殖情况及化疗药物表柔比星(EPI)处理后细胞增殖情况;用AV/PI法结合流式细胞仪检测细胞凋亡、细胞周期。结果:细胞增殖结果:在48、72、96 h时间点NRP-1/shRNA干扰组的OD值均低于相应对照组,差异有统计学意义(P<0.05),而阴性对照组与空白对照组差异无统计学意义(P>0.05);细胞凋亡率结果:与对照组比较,NRP-1/shRNA干扰组细胞的凋亡率明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);对化疗药物表柔比星(EPI)敏感性检测结果:EPI浓度为0.025、0.05、0.1、0.2、0.4μg/ml时,NRP-1/shRNA干扰组的细胞生长抑制率较相应对照组高,差异皆有统计学意义(P<0.05),并且选择IC50进行EPI诱导后,NRP-1/shRNA干扰组的细胞凋亡率明显升高,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);WB结果显示:与对照组相比,NRP-1/shRNA干扰组Bcl-2蛋白的表达水平明显下降,Bax的表达水平明显升高,差异均具有统计学意义(P<0.05);细胞周期结果:与对照组比较,NRP-1/shRNA干扰组G0/G1期细胞的比例增高,S期细胞的比例明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:RNAi沉默NRP-1基因可抑制Jurkat细胞增殖,促进其凋亡,提高对化疗药物的敏感性,其机制可能涉及Bcl-2/Bax途径的调节;并可将细胞周期阻滞在G0/G1期,降低细胞的增殖水平,诱导细胞进入凋亡期。

NRP-1在子宫内膜癌及子宫内膜异位症中的表达及意义

目的探讨神经纤毛蛋白-1(NRP-1)在子宫内膜异位症(内异症)患者异位及在位子宫内膜组织、子宫内膜癌组织中的表达及其意义。方法 36例卵巢子宫内膜异位囊肿患者、12例子宫内膜癌患者作为研究组,30例非内异症患者作为对照组。采用免疫组化技术,检测内异症患者在位子宫内膜及卵巢异位囊肿组织、子宫内膜癌组织、非内异症患者子宫内膜中NRP-1的表达情况。结果 (1)所有异位内膜、内膜癌组织中均可检测到NRP-1的表达。(2)内异症患者在位子宫内膜组织中NRP-1的表达强度低于同期对照组正常子宫内膜(P<0.05),且丧失正常子宫内膜表达的周期性变化。(3)内异症患者异位子宫内膜组织、内膜癌组织中NRP-1的表达强度高于在位子宫内膜(P<0.05),无正常内膜表达的周期性变化。结论内异症患者异位子宫内膜、子宫内膜癌组织中NRP-1的表达可能与其血管化程度有关;在位子宫内膜组织中NRP-1表达水平的减少,可能与内异症的生物学行为有关。

GST-NRP-1融合蛋白的原核表达及纯化

目的:构建带有GST标签的人NRP-1融合蛋白原核表达载体,在大肠埃希菌(E.coli)中诱导其表达,并进行包涵体的复性及纯化。方法:利用RT-PCR扩增人NRP-1基因,将其克隆至p CR-blunt载体,酶切制备NRP-1基因片段,插入表达载体p GEX-4T-1,生成p GEX-4T-1-NRP-1,转入BL21感受态细胞以IPTG诱导其蛋白的表达。裂解细菌后行Western blot检测GST-NRP-1融合蛋白的表达,表达的包涵体经复性后用Glutathione Sepharose 4B纯化。结果:RT-PCR扩增出NRP-1基因并连入p CR-blunt载体;经亚克隆构建了融合蛋白表达载体p GEX-4T-1-NRP-1。转入BL21感受态细胞后考马斯亮蓝染色检测到GST-NRP-1融合蛋白的表达,经包涵体复性后得到纯化的融合蛋白。结论:成功构建带有GST标签的人NRP-1融合蛋白原核表达载体,为进一步研究NRP-1的结构、功能及其与之相互作用的蛋白奠定了基础。