NMR studies of the interaction between Bacillis subtilis neutral proteinase and inorganic metal compounds

The interaction between Bacillis subtilis neutral proteinase (B.S.NP) and inorganic metal compounds (CoCI2, NiCI2) was investigated by 1H NMR spectroscopy. It has been shown that the Zn(Ⅱ) ion in the active center of the native enzyme may directly interact with external CoCI2 and NiCI2, producing Co(Ⅱ)- and Ni(Ⅱ)-substituted derivatives, and their 1H NMR spectra were obtained for the first time. From the 1H NMR spectra, the coordinated structure of the active center in the native enzyme was described.

酶法提取、超滤分离香菇多糖新工艺研究

采用中性蛋白酶辅助水提法提取香菇多糖,利用超滤膜分离多糖,研究了酶法提取条件和超滤膜及分离参数的选择。结果表明,中性蛋白酶在pH4．8,温度50℃,处理时间60min条件下,能有效提高多糖的提取率,降低杂质蛋白质的含量。采用截留分子量为50、300kD陶瓷超滤膜,在温度35℃,压力0．15MPa的中性环境下,能有效浓缩香菇多糖提取液,并将多糖分级为三部分:不含蛋白质的小分子量多糖、含少量蛋白质的中等分子量多糖和含大量蛋白质的大分子多糖。

中性蛋白酶发酵工艺优化研究

采用正交试验，对枯草芽孢杆菌ＨＤ４０１中性蛋白酶深层发酵工艺进行了优化，结果表明：较优发酵培养基为玉米粉５％、豆饼粉３％、麸皮４％、Ｎａ＿２ＨＰＯ＿４０．４％、ＫＨ＿２ＰＯ＿４０．０３％；在发酵中期流加蚕蛹水解液５％、植酸钙０．２％、吐温－８００．１％，对发酵后期有较大的调控作用。采用优化工艺，在２Ｌ发酵罐中进行验证试验，酶活达１３２００ｕ／ｍｌ，比原工艺提高了１６４％。

亚硝酸与紫外线复合诱变原生质体选育产酶菌株

目的：筛选出一株稳定、高产的产中性蛋白酶菌株。方法：以突变株UV_(11)(原生质体紫外诱变得到)为出发菌株,在原生质体形成与再生最佳条件下制备原生质体并进行亚硝酸与紫外线复合诱变。结果：得到突变株Bacillus subtilis UN_(19),产酶活力从最初的378．97U/ml提高到3965．84U/ml。结论：亚硝酸与紫外线复合诱变原生质体是一种很好的诱变方式。

虾夷扇贝生殖腺多肽的制备及分离

为了对扇贝加工副产物进行高值化利用,采用中性蛋白酶,分别以变性(100℃,10min)和未变性虾夷扇贝生殖腺匀浆为底物,经50℃酶解3h后制备不同的生殖腺水解液。结果表明,中性蛋白酶水解雌性虾夷扇贝生殖腺的效果优于雄性生殖腺,并且虾夷扇贝生殖腺经变性处理后,水解度和肽得率得到显著提高。与未变性处理组雌性虾夷扇贝生殖腺相比,变性处理组的水解度和肽得率分别提高了36.16%和94.78%。雌性虾夷扇贝生殖腺水解液经Sephadex G-25凝胶层析分离,发现变性处理后雌生殖腺水解液的组分更为集中,且具有一定的还原能力。经Superdex Peptide 10/300GL凝胶过滤色谱分析,变性处理后的雌生殖腺水解液分子质量主要分布在0.25～5ku,占水解液的74.78%。因此,利用中性蛋白酶并结合变性预处理,对雌性生殖腺可以进行有效水解,从水解液中可分离出具有还原能力的多肽。

中性蛋白酶对壳聚糖的降解

用粘度测定法和还原糖测定法，研究了中性蛋白酶非专一性降解壳聚糖过程中温度、ｐＨ 值、反应时间、酶浓度、底物浓度、金属离子及壳聚糖的脱乙酰度对中性蛋白酶降解壳聚糖反应速度的影响，确定了以壳聚糖为底物的中性蛋白酶的一些催化特性：最适温度为５０ ℃；最适ｐＨ 值为６ ．０ ；米氏常数 Ｋｍ 值为１ ．１ ×１０ － ２ ｇ／ ｍＬ；一定浓度的Ｃｕ２ ＋ 、Ｂａ２ ＋ 、Ｍｎ２ ＋ 抑制该酶的活性；ＩＣＨ２ ＣＯＯＨ 是激活剂。随着壳聚糖脱乙酰度的提高，降解速度降低。

海藻酸钠固定化中性蛋白酶的研究

探讨了中性蛋白酶在海藻酸钠中的固定化技术,并对影响固定化酶的固定化率和固定化酶活性的 因素进行了研究。结果表明,固定化酶的质量受海藻酸钠浓度、固定化酶量、固定化时间以及CaCl2浓度的影响,其 最佳工艺条件为:海藻酸钠浓度3．0％,固定化酶液量与海藻酸钠体积比1:2,固定化时间2．5 h,CaCl2浓度 3．0％,由此制得的固定化酶的固定化率可达97．5％,固定化酶活性为3 600 U／g,其热稳定性、pH值稳定性均极显 著高于游离酶。

AS1.398中性蛋白酶固定化条件的初步研究

考察壳聚糖、卡拉胶、海藻酸钠、琼脂等固定化载体对 AS1 .398中性蛋白酶固定化的影响。确定 0 .3%戊二醛在 30℃ ,p H8.0的条件下处理壳聚糖 8～ 1 0 h,加酶液 ,固定 8h,酶活力回收约为 77% ,固定化酶最适作用温度为 55℃ ,最适作用 p H为 8.0 ;

中性蛋白酶分步酶解花生分离蛋白制备花生短肽的研究

【目的】为了充分利用花生榨油之后的副产物,提高产品附加值,建立花生短肽制备工艺,研发功能性花生短肽产品。【方法】通过比较酶种类、底物浓度、酶解温度、酶解时间对水解度与短肽得率的影响,采用二次回归正交旋转组合设计优化分步酶解制备花生短肽的最佳工艺。【结果】中性蛋白酶分步酶解花生分离蛋白制备短肽的最佳工艺参数为:Neutrase水解花生分离蛋白2.04 h后加入Protamex继续酶解1.96 h,Neutrase添加量为5 200 U·g-1底物,Protamex添加量为422.32 U·g-1底物,水解温度44.83℃,底物浓度8%,在此条件下,短肽得率为83.93%,水解度为38.25%,花生短肽纯度为93.85%±0.44%。经高效液相色谱测定,分子量小于1 000 D的水解产物占98.88%。【结论】采用Neutrase与Protamex分步酶解花生分离蛋白制备花生短肽,与现有碱性蛋白酶酶解制备花生短肽方法相比,避免了后续脱盐步骤,简化了工艺,且具有制备条件温和,DH和TCA-NSI高,纯度高,分子量集中分布于1 000 D以下等特点。

双酶协同作用对大豆分离蛋白酶解的影响

从双酶配比、酶解pH值、酶解温度、酶解时间研究了中性蛋白酶(1398)和碱性蛋白酶(2709)对大豆分离蛋白酶解的影响,并运用正交试验设计和方差分析得到复合酶解最佳条件。单因素结果表明以双酶配比为1:3(1398:2709)、pH9.5、60℃和酶解3.5h时对水解较为有利。正交试验和方差分析表明,双酶配比(1398:2709)和pH值对酶解影响最为显著(P<0.05),酶解时间和温度对酶解影响最不显著(P>0.05)。

酶解制备吉尾鱼水解蛋白粉的工艺研究

以水解液中α-氨基态氮含量为指标,选用木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶和动物蛋白水解复合酶对吉尾鱼进行单酶水解,确定中性蛋白酶为水解用酶。通过正交实验确定的中性蛋白酶水解条件为肉:水=1:2、酶浓度1600IU/g原料、温度60℃、水解时间5h。验证实验表明,水解液中α-氨基态氮含量为1.764g/100g,水解度为62.2%。水解液经喷雾干燥,得到淡黄色,带海鲜味的粉末。

氨基末端磁性载体固定化中性蛋白酶的研究

以氨基末端磁微粒为载体 ,用戊二醛作交联剂 ,通过共价交联结合法固定化AS1 398中性蛋白酶 .可以制备出活力达 45 0 0 0U/ g磁性固定化酶 .探讨了该载体对中性蛋白酶的最适固定化条件 ,并对磁性固定化酶的热稳定性 ,储存稳定性、操作稳定性等进行了研究 ,确定了此载体对酶的固载能力大于 2 0 0mg/ g (载体 ) ,及固定化磁性酶最适 pH为 7 5 ,最适温度为 6

复合诱变原生质体选育高产中性蛋白酶菌株

为进一步提高菌株产中性蛋白酶能力,在原生质体最佳形成条件下制备得到Bacillus subtilis UN9原生质体,并对其进行紫外线与亚硝基胍复合诱变,通过摇瓶复筛,得到高产、稳定的突变株Bacillus subtilis Promax NTG14,产酶能力相比出发菌株提高了近24%,中性蛋白酶活力达4286.09U/mL。试验结果表明,复合诱变原生质体是一种快速、有效的优良产酶菌株选育途径。

酶法处理烟叶碎片制备烟草浸膏

为了实现烟叶碎片的再利用,开展了中性蛋白酶处理烟叶碎片提取物制备烟草浸膏的工艺研究。优化了pH调节剂、酶添加量、酶处理温度和酶处理时间,优化条件为：pH调节剂浓度为1 mol/L的氢氧化钠溶液,中性蛋白酶的质量浓度为6.0 g/L,酶处理温度40℃,酶处理时间4 h。与对照样品比较,酶法浸膏能改善烟气状态,降低刺激性,减少残留;烟叶碎片提取物中氨基酸质量分数增加了211.1%-316.7%,还原糖质量分数增加了8.0%-8.8%,蛋白质质量分数减少了11.2%-43.0%;且此酶法浸膏中含吡喃和吡嗪环状小分子结构的香气物质质量分数增加了5.5%,高分子醇、酸和烷烃质量分数减少45.5%,尼古丁质量分数降低了5.5%。

大豆分离蛋白的复合改性及其对某些功能性的影响

利用中性蛋白酶和微生物谷氨酰胺转胺酶(MTG)对大豆分离蛋白进行复合改性,通过单因素实验和正交实验研究,获得改性SPI最佳凝胶性的反应条件为:添加中性蛋白酶0.003%,水解20min;添加MTG0.5%,作用2.0h。获得最佳溶解性的反应条件为:添加中性蛋白酶0.005%,水解30min;添加MTG0.3%,作用1.0h。正交实验结果表明,双酶复合改性的最佳处理组合为添加中性蛋白酶0.005%,水解30min;添加MTG0.5%,作用1.0h,得到产品凝胶性为4226cp,比对照提高了36.3%,溶解性为70.1%,比对照降低了5.8%。

芽孢杆菌的产酶特性及其对抗生素的耐受性

以4株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和2株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)为研究对象,通过测定其成胞率、中性蛋白酶活性及对24种抗生素的耐受性,从中筛选优良芽孢杆菌。结果表明,从6株芽孢杆菌中筛选得到3株成胞率和产中性蛋白酶均较好的芽孢杆菌,分别为枯草芽孢杆菌BLCC1-0552、BLCC1-0615和地衣芽孢杆菌BLCC1-0441,液体发酵24 h后,成胞率较高,均达到98%;中性蛋白酶活性分别为90.58 U/mL、100.32 U/mL和24.72 U/mL。其中,枯草芽孢杆菌BLCC1-0615固体发酵玉米-豆粕型常规饲料产中性蛋白酶活力最高,发酵48 h时达到2154.49 U/g。3株芽孢杆菌对抗生素的耐受性不一致,其中枯草芽孢杆菌BLCC1-0615对24种抗生素中的17种表现敏感,敏感率最高为70.83%。因此,确定优良菌株为枯草芽孢杆菌BLCC1-0615,其成胞率、产中性蛋白酶能力好及对抗生素耐受性较低,具有作为饲料添加剂应用于畜禽饲料中的潜力。

复合酶解法制备功能性大豆多肽的研究

利用中性蛋白酶和枯草杆菌对大豆分离蛋白进行复合酶解,首先通过单因素和正交实验确定了中性蛋白酶酶解的最佳水解条件为：底物浓度4%,反应温度50℃,时间4h,pH8．5,酶用量6％,水解度(DH)可达21．46％；再经过枯草杆菌发酵36h后,水解度可迭32．06％,苦味明显降低。

中性蛋白酶法提取富硒羊肚菌菌丝体多糖的研究

目的:研究中性蛋白酶法提取富硒羊肚菌菌丝体多糖的条件,以提高菌丝体多糖的得率。方法:在单因素试验的基础上,进行正交试验设计,考察加酶量、酶解时间、酶解温度、料液比等因素对多糖提取率的影响。结果:确定了中性蛋白酶法提取富硒羊肚菌菌丝体多糖的最佳工艺:加酶量为1.5%,提取时间为2 h,酶解温度为40℃,料液比为1∶15,在此条件下,提取率可达11.26%。结论:本工艺简单、稳定、可行,适用于富硒羊肚菌菌丝体多糖的提取。

3942中性蛋白酶酶解中国毛虾蛋白制备血管紧张素转移酶抑制肽

采用3942中性蛋白酶酶解中国毛虾(Aceteschinensis)蛋白,制备具有抑制血管紧张素转移酶(ACE)活性的多肽。采取正交实验研究料水比、酶量、反应温度、反应时间4个因素对酶解中国毛虾蛋白产物的ACE抑制活性的影响。结果显示,在料水比1∶3(体积比),酶量0.5%,温度45℃,时间8h的水解条件下得到的酶解产物F7的ACE抑制活性最高,其抑制率达到92.86%。用层析柱SephadexG25、SPSephadexC50对F7进行分离纯化,选取ACE抑制活性最高的峰进一步用反相高压液相色谱进行纯化,得到单一组分FⅠ。经飞行时间质谱和碰撞诱导裂解分析确定,FⅠ为新型的ACE抑制肽SerPro,IC50值为272μmol/L。

中性蛋白酶B．S．HD401生产菌激光选育

本文报道了从花生地土壤分离到一株分泌中性蛋白酶的枯草芽孢杆菌，经纯铜蒸汽激光诱变，选育到一株高产菌株ＨＤ４０１，产酶提高幅度高达７２．７％。诱变过程说明，菌体存活率和正变率以及激光波长、孢子体生理状态有一定的相关性。Ｂ．Ｓ．ＨＤ４０１经多次传代，产酶性状稳定，通过正交试验对培养基进行优化，在２升罐中酶活达８５２０ｕ／ｍｌ。