霍乱弧菌不同血清群NhaA基因的变异性分析

目的：克隆霍乱弧菌O1群和O139群NhaA基因，并分析其变异性。方法：收集我国散发霍乱弧菌O1群和O139群40株，用PCR方法扩增NhaA基因，克隆至pcDNA3载体，通过序列测定分析其同原性和变异性。结果：分别从霍乱弧菌O1群和O139群扩增出约1．2kb的NhaA基因片段，基因序列分析表明，我国霍乱散发O1群和O139群的NhaA基因与GENEBANK中霍乱弧菌O1群野毒株参考序列同源性分别为99％和96％。编码氨基酸的突变率相近(均为2％)，NhaA基因重要的结构和功能决定簇(Asp133，Asp163，Asp164，His225，Leu73和Gly338)未发生变异；第204、222位的氨基酸，O1群和O139群发生相同的变异(Gly→Ala，Gly→Glu)。结论：成功扩增并克隆我国散发霍乱O1群和O139群NhaA基因为研究霍乱流行规律和基因疫苗提供重要的实验依据，NhaA基因编码氨基酸的变异可能是霍乱弧菌适应外环境变化的结果。

霍乱弧菌O1群和O139群nhaA基因的克隆和变异性研究

目的 克隆霍乱弧菌O1群和O139群nhaA基因 ,并分析其变异性。方法 收集我国1988～ 2 0 0 0年散发霍乱弧菌O1群和O139群 40株 ,用聚合酶链反应 (PCR)扩增nhaA基因 ,克隆至pcDNA3载体 ,通过序列测定分析其同源性和变异性。结果 分别从霍乱弧菌O1群和O139群扩增出约 1.2kb的nhaA基因片段 ,基因序列分析表明 ,我国霍乱散发O1群和O139群的nhaA基因与Genbank中霍乱弧菌O1群野毒株参考序列同源性分别为 99%和 96 %。编码氨基酸的突变率分别为2 %和 11%,nhaA基因重要的结构和功能决定簇 (Asp133、Asp16 3、Asp16 4、His2 2 5、Leu73和Gly338)未发生变异 ;第 2 0 3、2 2 1位的氨基酸 ,O1群和O139群发生相同的变异。结论 nhaA基因编码氨基酸的变异可能是霍乱弧菌适应外环境变化的结果。

施氏假单胞菌Na^+/H^+逆向转运蛋白基因nhaA的克隆与表达分析

Na+/H+逆向转运蛋白是生物耐盐的关键因子,能够维持高盐胁迫下生物体的正常生长代谢。利用PCR技术从施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)中克隆质膜Na+/H+逆向转运蛋白基因nhaA。序列分析表明,该基因全长1167bp,编码388个氨基酸,含有12个跨膜结构域和保守的功能氨基酸残基位点:Asp-133、Asp-163、Asp-164、His-225、Gly-338。与大肠杆菌nhaA基因核苷酸和编码氨基酸序列的同源性分别为99%和99.2%。将该基因与pET-28a构建成原核表达载体pET-nhaA,转化E.coli BL21,经IPTG诱导后获得相对分子量约为41kD的蛋白。平板法和生长曲线法检测表明,重组菌在800mmol/LNaCl胁迫下仍能正常生长,耐盐能力显著提高。以上结果证实克隆到的基因是施氏假单胞菌nhaA基因家族的成员,具有盐胁迫下将Na+逆向转运至胞外的功能,为进一步利用该基因进行作物耐盐改良奠定了基础。该基因的GenBank登录号为EU545468。

转Na^+/H^+逆向转运蛋白基因(nhaA)大豆植株的获得及耐盐性分析

高盐对作物造成渗透胁迫和离子毒害,是影响作物生长发育的主要非生物胁迫因子之一。Na+/H+逆向转运蛋白能够通过将Na+排出细胞或将其区隔化入液泡中来调节细胞内的离子平衡,是植物耐盐的关键因子。本研究将质膜Na+/H+逆向转运蛋白基因nhaA构建到植物表达载体pBI121上,通过发根农杆菌介导转化大豆子叶节,获得6株卡那霉素抗性再生植株。对抗性植株进行PCR、Southern blot和RT-PCR鉴定,3株植株呈阳性,平均转化率为0.42%。对阳性植株的耐盐生理指标测定结果显示,盐胁迫后转基因植株的质膜相对电导率显著低于对照植株,叶绿素含量和脯氨酸含量显著高于对照植株。nhaA基因在大豆植株中的表达显著提高了大豆对盐胁迫的耐受性,为大豆耐盐新品种的选育和广泛应用该基因进行其它农作物的耐盐性改良提供了材料和依据。