血链球菌部分基因克隆及与nif基因同源序列初探

目的：分析血链球菌染色体ＤＮＡ片段序列，探讨血链球菌遗传生物学特性。方法：采用ＴＡ克隆技术将此片段转化克隆并进行碱基序列测定，通过ＧｅｎＢａｎｋ进行同源分析。结果：血链球菌ＡＴＣＣ１０５５６ＤＮＡ片段含有与固氮菌高度同源的ｎｉｆＳ、ｎｉｆＵ基因，同源分值为１１４点（ｂｉｔｓ）。结论：国内外首次报道血链球菌ＤＮＡ片段含有ｎｉｆＳ、ｎｉｆＵ部分基因。

异源nifA^C对根癌土壤杆菌nif基因表达的调节作用

用三亲交配方法分别将载有褐球固氮菌（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒｃｈｒｏｏｃｏｃｕｍ）呈组成型表达的ｎｉｆＡＣ的质粒ｐＣＫ５和肺炎克氏杆菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）含有ｎｉｆＡＣ和ｎｉｆＡｎｔｒＣ基因的质粒ｐＣＫ３，ｐＳＺ３６和ｐＳＺ２３ＣＡ导入根癌土壤杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）Ｃ５８／ｐＧＶ３８５０，所得转移接合子的生长速率和野生型相似。在１０ｍｍｏｌ／ＬＮＨ４＋浓度下，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ测出ＡｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓＣ５８／ｐＧＶ３８５０（ｐＣＫ５）有固氮酶合成，乙炔还原法测定固氮酶活性恢复分别为７３％，２４％，１１％和６２％。这些结果表明，褐球固氮菌和肺炎克氏杆菌的固氮调节基因对土壤杆菌固氮基因表达有调节作用。其中，褐球固氮菌ｎｉｆＡＣ的调节功能最强（７３％），其次是肺炎克氏杆菌ｎｉｆＡ和ｎｔｒＣ的融合子（６２％），肺炎克氏杆菌ｎｉｆＡＣ的调节功能较弱（２４％，１１％）。

水稻联合固氮菌质粒的鉴定及固氮(nif)基因定位

应用改进的Casse法提取质粒,鉴定了供试菌株的质粒存在情况:高NH_4^+和N_2培养的Alcaligenes faecalis A_15,Enterobacter cloacae E26,E.cloacaeEnSs和klebsiella planticola DWUL2分别携有1—2个大质粒,分子量在30—200Md之间;K.planficola和Pseudomonas saccharophila含有小质粒;K.oxytocaNG13不携质粒。供试菌株中DNA与nif探针R1 nif DH和Ec nif B-Y均具有同源性。A.faecalis A15,E.cloacae E26和K.oxytoca NG13的nif基因位于染色体上,而E.cloacae EnSs的nif基因则位于一个较大质粒上。

念珠藻属植物nifH基因的适应性进化分析

念珠藻(Nostoc)固氮过程关键在于固氮酶的催化,而固氮酶复合物中的铁蛋白(NifH)是由高度保守的nif H基因编码的,该基因是进化史上现存最古老的功能基因之一。该研究选取念珠藻属及近缘类群的nif H基因序列共40条,采用最大似然法构建系统发育树;运行PAML4.9软件,对nif H基因编码蛋白进行生物信息学分析,并使用分支模型、位点模型和分支-位点模型检测该基因的选择位点,探讨nif H基因的适应性进化特征。结果表明:(1)最大似然树显示内类群中该研究物种共分为6个分支(A、B、C、D、E和F),其中D和E是2个大的分支,每个大分支中又各包含2个特殊的小分支A、F和B、C,其中F分支包含新疆古尔班通古特沙漠采集到的9株念珠藻,A分支包含F分支及该研究测定序列的4株葛仙米,B分支包含本研究测定序列的4株地皮菜和3株未定种的念珠藻,C分支包含NCBI数据库中下载的5株念珠藻、鱼腥藻序列和本研究测定序列的1株念珠藻。(2)在所分析的3种进化模型中,仅通过分支-位点模型检测出14个统计学上显著的正选择位点,即1F、2S、3S、4T、5A、6F、7F、8I、9S、10C、17I、27Y、29D和31R位点,表明念珠藻属植物的nif H基因发生了适应性变化,分支-位点模型是研究藻类基因适应性进化较好的模型。

荒漠植物柠条根际土壤nifH基因荧光定量及固氮菌多样性分析

探索荒漠固沙植物根际土壤nif H基因丰度信息和固氮菌群落结构组成和多样性,可为丰富荒漠区微生物资源库提供基础资料。通过实时荧光定量PCR和高通量测序方法,分析了宁夏荒漠区5个柠条林地根际土壤nif H基因丰度和固氮菌群落结构组成,并结合分离培养方法对柠条根际固氮菌进行筛选和多样性研究。结果表明,5个柠条群落根际土壤nif H基因的拷贝数存在较大的差异,罗山林地(LS)nif H基因拷贝数最高,沙坡头林地(SPT)最低。柠条根际土壤共检测到固氮菌7门12纲26科30属。在科属水平上,沙坡头林地固氮菌群落组成差异较大,未分类的变形杆菌和叶杆菌科分别占25.54%和22.77%,红螺菌科占17.43%,中慢生根瘤菌属是其优势属,相对丰度为22.77%;其余4个林地均以红螺菌科、斯科曼氏球菌属为优势类群,相对丰度分别为23.71%-73.45%和23.19%-71.14%,在罗山林地中占比最高。分离出的固氮菌隶属于15个属,除常见的假单胞菌属、根瘤菌属和肠杆菌属等固氮类群外,还包括勒克氏菌属、金黄杆菌属和寡养单胞菌属等,多样性十分丰富。

农业基因工程的若干进展

近年来,农业方面利用重组DNA技术已收益不浅,如猪、牛幼畜腹泻疫苗已投放市场,目前牛生长激素已投产,口蹄疫亚单位疫苗、牛干扰素、狂犬病毒疫苗以及若干杀虫剂也用工程菌进行试产。但是,与医药卫生、轻工食品、工业环保方面的成就相比,农业基因工程尤其是高等植物基因工程相对处于后进状态。这引起有关科学家的关注,因此,无论是量上还是质上,近年有令人瞩目的进展。

固氮酶的研究进展

固氮酶将N2还原为NH3的过程是自然界实现氮循环的重要环节。固氮酶是由γ2型二聚体组成的Fe蛋白和α2β2异四聚体组成的MoFe蛋白组成。固氮酶催化的机制包括铁蛋白的氧还循环和钼铁蛋白的氧还循环两部分。Klebsiella pneumoniae的nif基因簇由20个基因组成,构成了8个转录单位,总长度24206bp,其操控机制是多水平、多层次的调控过程。同时综述了固氮酶的多样性,目前已经发现的有钼铁固氮酶、钒铁固氮酶、铁铁固氮酶以及在Strpomyces thermoauophicus内存在的与已知的三种固氮酶体系明显不同的固氮体系。

血链球菌特异DNA片段探针制备及临床应用

目的：探讨血链球菌特异ＤＮＡ片段探针制备及临床应用。方法：采用特异引物的ＰＣＲ扩增及运用探针进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交，斑点杂交来检测口腔链球菌同源序列。结果：Ｓ３４ｓｒ，Ｓ３４非１和ＡＴＣＣ１０５５６的ＤＮＡ含有同源序列，另有两株血链球菌临床分离株斑点杂交结果为弱阳性，其它３０余株细胞杂交结果阳性。结论：血链球菌ＡＴＣＣ１０５５６菌株中的ｎｉｆ基因为血链球菌的特异基因，该基因在血链球菌蛋白的表达及功能尚待深入探讨。

血链球菌与nifs、nifu基因同源序列分析

目的对具有一定的特异性和稳定性的血链球菌ＡＴＣＣ１０５５６染色体一８００ｂｐＤＮＡ片段进行基因序列分析。方法采用ＴＡ克隆技术并进行碱基序列测定，通过ＧｅｎｅＢａｎｋ进行同源分析。结果ＡＴＣＣ１０５５６ＤＮＡ片段氨基酸序列含有与固氮酶ｎｉｆｓ、ｎｉｆｕ基因同源序列，同源率分别为７２％，７１％。与非固氮菌中的磷酸吡哆醛依赖性氨基酸转移酶基因也具有同源性，同源率６３％。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交表明，与血链球菌ＡＴＣＣ１０５５６相似的另２株血链球菌含有同样的ｎｉｆｓ、ｎｉｆｕ基因，而其它亲源相近的口腔链球菌，如血链球菌ＪＦｒ菌株，变链球菌血清型ｃ、ｄ、ｆ参考菌株及唾液链球菌ＨＨＴ参考株不含有同样ｎｉｆ基因。结论血链球菌ＡＴＣＣ１０５５６含有的ｎｉｆ基因具有一定特异性，其基因结构及其生理性功能尚待深入研究。

携带Paenibacillus polymyxa WLY78固氮基因簇(nif)的重组大肠杆菌Escherichia coli 78-7转录组分析（英文）

【目的】来自Paenibacillus polymyxa WLY78的固氮基因簇(nifBHDKEf NXhesAnifV)可以转化入Escherichia coli中表达并使重组大肠杆菌合成有固氮活性的固氮酶。本文拟通过对重组大肠杆菌E.coli78-7的转录组分析以提高其固氮能力。【方法】对固氮条件(无氧无NH+4)和非固氮条件(空气和100 mmol/L NH_4^+)培养的重组大肠杆菌E.coli 78-7进行转录组分析。【结果】nif基因在两种培养条件下显著表达,说明在重组大肠杆菌中可规避原菌中氧气和NH_4^+对nif基因的负调控。对于固氮过程必需的非nif基因,如参与钼、硫、铁元素转运的mod、cys和feoAB,这些基因在两种培养条件下表达水平有差异。而参与铁硫簇合成的suf和isc基因簇在两条件下表达水平差异巨大。此外,参与氮代谢的基因在固氮条件下显著上调。【结论】重组大肠杆菌中与固氮相关的非nif基因在该菌的固氮过程中具有较大影响,本文对在异源宿主中调高固氮酶活性研究具有重要意义。

第10届北美根瘤菌会议

第10届北美根瘤菌会议于1985年8月在美国夏威夷大学举行。参加代表174人,分别来自美洲、欧洲、亚洲、非洲、大洋洲的37个国家。我国旅美学者和留学生也参加了会议。 从本届会议交流的论文来看,对根瘤菌研究和应用的进展有以下几个方面。

泗顶矿区剖层土固氮微生物群落结构和丰度

以广西柳州泗顶矿区的上游区、下游区和尾矿区12个剖层土(每个区域分为4层)为研究对象,采用高通量测序技术和荧光定量PCR技术,分析了剖层土中固氮微生物的群落结构、丰度和多样性特征.结果表明,变形菌门在各区域剖层土中均为优势菌门,所占比例超过70%;α-变形菌纲在上游区和下游区剖层土中均为优势菌纲.上游区、下游区和尾矿区剖层土固氮微生物nifH基因丰度的范围分别为3.02×10^(6)~1.17×10^(7)、2.55×10^(6)~7.78×10^(6)和8.19×10^(5)~3.14×10^(6)基因拷贝数/g(干土).主要影响nifH基因丰度的土壤环境因素是土壤氮(总氮、铵态氮和硝态氮)和磷(总磷和有效磷)的含量.矿区固氮微生物群落组成的差异性主要由土壤铅、锌和镉含量的变化所引起,上游区剖层土的Shannon指数和ACE指数显著高于下游区和尾矿区,表明上游区剖层土固氮微生物群落的多样性和丰富程度相对较高.另外,土壤钾、钙和钠含量的变化对固氮微生物群落的ACE指数和NMDS1指数也产生了不同程度的影响.研究结果表明土壤环境因子变化影响了矿区剖层土固氮微生物的群落结构、丰度和多样性.研究为矿区的氮素调控、生态恢复和重建提供了理论依据.

固氮类芽孢杆菌的分离鉴定及其促生、抑菌活性的测定

固氮类芽孢杆菌是一类能产生芽孢、具有固氮能力的革兰氏阳性细菌。这类菌除固氮活性和抗逆力强外,有些菌株还具有促进植物生长、对植物病原菌有抑制作用、耐贮藏等特点,被认为是制备微生物肥料的优良菌种之一,但目前经过鉴定的菌种资源十分有限。从全国20个省不同地理环境、不同种类植物根际采集分离筛选获得500个菌株,从中鉴定出60个具有固氮结构基因(nif H)的分离株,通过对其中17个分离株的nif H和16S rRNA基因序列的比对分析,初步确定了它们的系统发育地位,17个分离株均属于固氮类芽孢杆菌,而且这17个菌株全部具有固氮酶活性,最高达到2 109.9±131.1 nmol/mg·h。进一步分析,其中5株具有IAA分泌能力,最高为49.908±3.6μg/m L,11株对4种常见植物病原菌表现出抑制作用。在17个分离株中,共发现了5株兼具固氮、分泌IAA以及抑制植物病原菌的特点,其中IAA分泌能力最低的BJ-18对番茄幼苗仍具有显著的促生作用。分离和鉴定的固氮类芽孢杆菌丰富了固氮微生物菌种资源,发现的兼具固氮、分泌IAA以及抑制植物病原菌的固氮类芽孢杆菌在农业生产中具有潜在的广泛应用前景。