导入dctABD和nifA基因对费氏中华根瘤菌共生固氮的影响研究

以pTR10 2为载体构建重组质粒pHN30 7,其上克隆有来自苜蓿中华根瘤菌 (Sinorhizobiummeliloti)的四碳二羧酸转移酶基因dctABD、来自肺炎克氏杆菌 (Klebsiellapneumoniae)的nifA基因和来自pDB30所含的发光酶基因lux AB。经三亲本接合转移 ,将pHN30 7导入费氏中华根瘤菌 (S .fredii)HN0 1、YC4和GR3,并考察了转移接合子中pHN30 7在传代培养和共生条件下的稳定性。与出发菌相比较的植物盆栽试验结果表明 ,在与大豆黑农 33共生时 ,导入pHN30 7后的转移接合子均可显著提高结瘤植株的瘤重、地上部分干重和地上部分总氮量。在与大豆川早一号共生时 ,转移接合子HN0 1(pHN30 7)可显著提高结瘤植株的瘤数和瘤重 ;GR3(pHN30 7)可显著提高结瘤植株的瘤数、瘤重、地上部分干重和地上部分总氮量 ;导入pHN30 7的YC4却呈现出负作用。本研究表明 ,导入dctABD可提高固氮效率 ,而nifA基因主要影响重组菌的结瘤能力 。

巴西固氮螺菌Yu62 nifA基因克隆、测序及功能分析

用TD PCR法克隆了巴西固氮螺菌 (Azospirillunbrasilense)Yu6 2的nifA基因。序列分析表明它与巴西固氮螺菌Sp7的nifA序列高度同源 (96 5 % ) ,其编码的产物NifA蛋白与Sp7菌株NifA的氨基酸序列同源性为 97 6 %。该基因可以完全互补巴西固氮螺菌Sp7nifA- 突变株的Nif- 表型。研究了NH4+ 和O2 对Yu6 2nifA基因的表达及NifA活性的影响。结果表明 :nifA基因在Yu6 2菌株中是部分组成型表达的 ,氨和氧不能完全阻遏其表达 ,在 5mmol LNH4 Cl与微氧 (0 5 %O2 )条件下表达最高 ;NifA蛋白在 0 4%～ 0 5 %O2 时活性最高 ,氧分压降低和提高都使NifA活性下降 ,1mmol LNH4 Cl足以抑制NifA的活性。

厚荚相思树根瘤菌HJ06菌株的16SrDNA全序列和nifA基因片段分析

对厚荚相思(Acaciacrassicarpa)根瘤菌HJ06菌株的16SrDNA全序列和nifA基因片段进行了测定。结果表明,HJ06菌株在以16SrDNA序列构建的系统发育树状图中位于根瘤菌属(Rhizobium)分支中,与根瘤菌属各个种的相似性达95%以上;从HJ06菌株克隆出的585bpnifA基因片段与Klebsiellapneumoniae的同源性达到99.3%,与Klebsiellaoxytoca的NifF,NifL,NifA,NifB蛋白基因的同源性为97.8%。

肺炎克氏杆菌NifA对巴西固氮螺菌nifH启动子的转录激活作用

用PCR方法克隆了巴西固氮螺菌Yu62nifH的启动子片段,DNA序列分析表明菌株Yu62与标准菌株Sp7之间的DNA序列差异很小。利用启动子探针质粒载体pCB182,构建了3个不同的nifH::lacZ转录融合质粒,在大肠杆菌中分别测定肺炎克氏杆菌NifA对它们的转录激活作用。结果表明巴西固氮螺菌nifH启动子的转录是依赖于NifA的,缺失了上游激活序列的启动子不能被NifA激活转录,肺炎克氏杆菌NifA对其自身nifH及巴西固氮螺菌nifH启动子的转录激活作用并无很大差异。

苜蓿根瘤菌转SmnifA基因研究初报

外源固氮调节基因nifA的导入对根瘤菌的结瘤固氮效率有较明显的促进作用。首先构建带有SmnifA基因的重组质粒,再利用三亲本杂交技术将重组质粒转移至苜蓿根瘤菌XM-1中,得到组成型表达SmnifA基因的菌株,侵染苜蓿后,植株鲜重、干重、含氮量、结瘤数、固氮酶活等指标均优于原始出发菌。

导入额外拷贝nifA基因对费氏中华根瘤菌HN0 1NL根圈定殖与竞争结瘤的影响(英文)

本文研究了导入额外拷贝的肺炎克氏杆菌 (Klebsiellapneumoniae)nifA基因对受体费氏中华根瘤菌 (Sinorhizobiumfredii)HN0 1在大豆根圈的定殖和竞争结瘤的影响。将HN0 1分别与带有标记基因luxAB的参照菌株HN0 1L和带有nifA基因和标记基因luxAB的重组菌株HN0 1NL按照 1∶1等量比例接种于大豆黑龙 3 3种子表面 ,在灭菌土和非灭菌土中研究其定殖动态。每一供试菌株在根圈中的比例依次于播种后第 3天、第 7天、第 1 0天、第 1 2天、第 1 4天、第 1 6天、第 2 1天和第 3 6天进行测定 ,占瘤率在播种后第 4 0天进行比较测定。盆栽实验结果表明 :导入了额外拷贝nifA基因的重组菌HN0 1NL与受体菌HN0 1和参照菌HN0 1L相比较 。

几种固氮菌nifA基因片段的同源性分析

参照已知数种固氮菌 nifA 基因的 DNA 序列,选择其中间区域的两个保守性较强的序列合成引物,利用肺炎克氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)、棕色固氮菌(Azotobacter vinela-ndii)、巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)、草螺菌(Herbaspirillum seropedicae)和深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)的总 DNA 进行聚合酶链反应,结果均扩增出约450bp大小的片段,经证实为各种固氮菌的 nifA 基因部分片段。核酸印迹分子杂交结果显示出nifA 基因在不同固氮菌中的同源性不强。

导入额外拷贝nifA基因对费氏中华根瘤菌共生固氮作用的影响

以广宿主、稳定性质粒pTR102为载体构建重组质粒pHN306，其上克隆有来自肺炎克氏杆菌（Klebsiellapneumoniae）的nifA基因和来自pDB30所含的发光酶标记基因（luxAB）。经三亲本接合转移，将pHN306导入费氏中华根瘤菌（Sinorhizobiumfredii）HN01，GR3和YC4。与出发菌相比较的盆栽试验结果表明：HN01（pHN306）和GR3（pHN306）分别在大豆渝豆一号和黑龙33上能显著提高瘤数，瘤重，植株地上部分干重和总氮量，YC4（pHN306）在大豆渝豆一号上也能显著提高瘤数，癌重和总氮量，对植株地上部分干重表现出一定的促进作用。结果表明：nifA基因对固氮效率和结瘤能力的促进作用与受体根瘤菌和大豆品种等因素有关。以luxAB为报告基因进行的菌落和根瘤发光检测结果表明：pHN306可在供试根瘤菌中稳定遗传。

异源nifA^C对根癌土壤杆菌nif基因表达的调节作用

用三亲交配方法分别将载有褐球固氮菌（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒｃｈｒｏｏｃｏｃｕｍ）呈组成型表达的ｎｉｆＡＣ的质粒ｐＣＫ５和肺炎克氏杆菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）含有ｎｉｆＡＣ和ｎｉｆＡｎｔｒＣ基因的质粒ｐＣＫ３，ｐＳＺ３６和ｐＳＺ２３ＣＡ导入根癌土壤杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）Ｃ５８／ｐＧＶ３８５０，所得转移接合子的生长速率和野生型相似。在１０ｍｍｏｌ／ＬＮＨ４＋浓度下，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ测出ＡｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓＣ５８／ｐＧＶ３８５０（ｐＣＫ５）有固氮酶合成，乙炔还原法测定固氮酶活性恢复分别为７３％，２４％，１１％和６２％。这些结果表明，褐球固氮菌和肺炎克氏杆菌的固氮调节基因对土壤杆菌固氮基因表达有调节作用。其中，褐球固氮菌ｎｉｆＡＣ的调节功能最强（７３％），其次是肺炎克氏杆菌ｎｉｆＡ和ｎｔｒＣ的融合子（６２％），肺炎克氏杆菌ｎｉｆＡＣ的调节功能较弱（２４％，１１％）。

导入额外拷贝nifA基因的大豆根瘤菌工程菌株的构建

以快生型大豆根瘤菌(Sinorhizobium fredii)15067的基因组DNA为模板,采用PCR技术,克隆固氮基因nifA全长;将其连入带有lac启动子下游,构建带有LuxAB基因标记的表达载体pTR102,采用三亲本杂交技术转化土著大豆根瘤菌中,构建大豆根瘤菌工程菌株。为研究转基因工程菌株对大豆固氮能力的影响奠定基础。

苜蓿中华根瘤菌nifA基因突变影响多种细胞学过程(英文)

苜蓿中华根瘤菌nifA基因在共生固氮过程中担负着调控功能,nifA突变株Rm1354在宿主植物的根部诱导白色无效根瘤。本文报道Rm1354在自生状态下的表型变化。nifA的突变导致根瘤菌在半固体培养基上泳动变慢,胞外蛋白含量降低。有趣的是,Rm1354在延宕期间高丝氨酸内酯含量比野生型低,在指数期和静止期却比野生型高。另外,突变株Rm1354的竞争结瘤能力也大大减弱。这些结果揭示了苜蓿中华根瘤菌nifA基因对许多细胞学过程都有调控作用。

稻田土壤DNA的提取及nifA基因的PCR扩增

为弄清茅贡米土壤微生物群落结构和生物固氮等代谢活动机制,采用试剂盒、SDS高盐和土壤预处理+SDS高盐3种土壤DNA提取方法,以从贵州茅贡米基地采集的土样提取的宏基因组DNA为模板,进行nifA基因的PCR扩增,比较了3种土壤DNA提取方法的效果。结果表明,试剂盒提取的DNA扩增到约200bp和900bp的nifA基因片段,SDS高盐法、预处理+SDS高盐法提取的DNA仅扩增到约200bp的nifA基因片段,土壤预处理对提高DNA纯度有一定的效果;3种方法都可以从土壤中提取到约23kb大小的DNA片段,但DNA得率和纯度存在一定的差异。

含肺炎克氏杆菌nifA基因的重组大豆根瘤菌的施用效应

通过 5年的田间试验 ,对含肺炎克氏杆菌nifA基因的重组大豆根瘤菌的施用效应进行了研究。试验表明 :含肺炎克氏杆菌nifA基因重组大豆根瘤菌工程菌株的固N能力较之出发菌有较显著的差异。在大豆分枝期 ,接种工程菌的大豆其株高、株重、根瘤固N酶活力较之空白对照和出发菌均有较大的提高。其中 ,固N酶活力分别比空白对照和出发菌提高大约 2倍及 1倍 ;田间产量比空白对照提高 10 %左右 ,比出发菌提高 5 %左右 。

肺炎克氏杆菌nifA基因在巴西固氮螺菌固氮基因表达的铵调节中的作用

固氮螺菌(Azospirillum)是一类仅在限铵和微好氧条件下固氮的微生物,它可与许多禾本科作物联合共生,具有较大的应用潜力。铵作为固氮作用的调节信号,在固氮螺菌的实际应用中是首要的限制因素。在固氮螺菌中,铵不但具有与肺炎克氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)相似的阻遏固氮酶合成的作用,而且还对已合成的固氮酶进行活性调节。

导入detABD和nifA基因对苜蓿中华根瘤菌共生固氮效率的影响

将克隆有四碳二羧酸转移酶基因dctABD、nifA基因和发光酶基因luxAB的重组质粒pHN307经三亲本杂交分别导入苜蓿根瘤菌HNM1、HNM2、HNM4和1021中得到HNM1(pHN307)等4个转移接合子,进一步比较研究了pHN307在自生培养条件下传代的稳定性,并采用本室改进的双层钵无菌砂培盆栽法,分别将4个转移接合子和出发菌接种到苜蓿品种草原1号,公农1号和图牧2号。结果表明,只有用转移接合子HNM4(pHN307)和1021(pHN307)接种到草原1号和图牧2号的植株鲜重和干重明显优于出发菌。

根瘤菌中固氮正调节基因nifA的研究

nifA是共生固氮的正调节基因。nifA基因调节固氮基因的表达伴随着一系列信号交换过程,在植物根部形成特定的器官——根瘤,将大气中的N2还原成铵供给植物作为生长的氮源。同时,植物向类菌体提供光合产物和氨基酸作为其生长的碳源。固氮基因在nifA产物NifA激活下表达,固氮过程由此开始。nifA为固氮基因nif/fix的正调节基因。针对nifA基因的位置及其产物NifA的结构和功能作一综述。

华葵根瘤菌nifA基因的克隆和功能分析

华葵根瘤菌 (Mesorhizobiumhuakuii即R .astragali) 1 59的nifA基因的序列分析表明 ,该基因全长 1 2 2 7bp ,编码分子量为 44734D的NifA蛋白。与其它NifA蛋白的序列比较发现 ,华葵根瘤菌NifA蛋白也存在保守的中间结构域和C 末端DNA结合结构域 ,但其氨基端缺失。Tn5定点突变得到的突变体是Nif- 表型。构建了nifA基因组成型表达的质粒 ,此质粒在大肠杆菌中对华葵根瘤菌nifH lacZ有激活作用。

携带双拷贝nifA基因慢生性大豆根瘤菌田间应用的初步研究

将带有组成型ｎｉｆＡ基因的质粒导入慢生性大豆根瘤菌２２１０中，得到携带双拷贝ｎｉｆＡ基因的慢生性大豆根瘤菌２２１０的重组菌：Ａ２、Ａ３、Ａ９、Ａ６１、Ａ６２。以亲本２２１０作为对照进行盆栽试验，并选其中具有较强固氮能力的Ａ６２与亲本２２１０和另１个重组菌Ａ６１于黑龙江进行田间小区试验。结果表明，以Ａ６２接种的小区单位产量高出对照１２６％，而其亲本２２１０接种的小区单位产量仅高出对照２８％。在河南进行的田间小区试验，再次显示Ａ６２的增产能力。

肺炎克氏杆菌的nifA基因产物在巴西固氮螺菌中的功效

通过三亲本杂交将质粒 pCK3[携带改变了启动子的肺炎克氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)nifA 基因]引入巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)Yu62菌株中,由此获得的转移接合子巴西固氮螺菌 Yu62-4菌株在6.0 mmol/L 以上 NH^+_4浓度下,能表现出微弱的固氮酶活性(相当于无 NH^+_4时活性的0.3—0.5%),而野生型 Yu62则全部丧失固氮酶活性。固氮酶的丙烯酰胺凝胶电泳和铁蛋白的免疫杂交实验表明,转移接合子 Yu62-4在高 NH^+_4(50mmol/L)下,虽有铁蛋白合成,但合成量比无 NH^+_4时少得多,而且有一部分铁蛋白未被共价修饰;野生型菌株 Yu62在此 NH^+_4浓度下无铁蛋白合成。实验结果表明:外源(来自肺炎克。’氏杆菌)的基因产物在巴西固氮螺菌 Yu62中不能有效地解除 NH^+_4对该菌固氮酶合成的阻遏作用。本文分析了出现这种现象的原因。

阴沟肠杆菌Tn5－nifA重组质粒的构建及其nifA的表达分析

构建的重组质粒ＰＢＦ１０１带有阴沟肠杆菌（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｃｌｏａｃａｅ）Ｅ２６固氮基因ｎｉｆＡ片段，该质粒具有广泛宿主范围接合转移特性和转座子Ｔｎ５的转座作用。验证了Ｅ２６ｎｉｆＡ产物能激活肺炎克氏杆菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ｎｉｆＨ启动子的表达，解除氨对固氮酶合成的阻遏作用。发现当ＰＢＦ１０１引入自生固氮催娩克氏杆菌（Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ）ＮＧ１３后，可观察到固氮酶的组成型生成，同时在３９℃高温条件下的细菌仍能检测到部分固氮活性。