Preparation of cross-linked enzyme aggregates of nitrile hydratase ES-NHT-118 from E.coli by macromolecular cross-linking agent

Cross-linked enzyme aggregates(CLEAs) of nitrile hydratase(NHase) ES-NHT-118 from Escherichia coli were prepared by using ammonium sulfate as precipitating agent followed by cross-linking with dextran polyaldehyde for the first time. In this process, egg white was added as protein feeder for facilitating the formation of CLEAs. The optimal conditions of the immobilization process were determined. Michaelis constants(Km) of free NHase and NHase CLEAs were also determined. The NHase CLEAs exhibited increased stability at varied pH and temperature conditions compared to its free counterpart. When exposed to high concentrations of acrylamide, NHase CLEAs also exhibited effective catalytic activity.

微生物法生产丙烯酰胺的研究(Ⅱ)——腈水合酶催化反应动力学与失活动力学

在以丙烯腈为原料 ,微生物转化生产丙烯酰胺的过程中 ,酶催化反应是过程的关键。为了了解酶催化的动力学 ,本研究以自由细胞的酶为催化剂 ,进行了腈水合酶的反应动力学和失活动力学的研究。首先研究了菌体浓度、温度、pH值、丙烯腈浓度、丙烯酰胺浓度等对腈水合酶催化反应速度的影响。结果表明 ,在这些因素中 ,温度和丙烯酰胺浓度是最主要的影响因素。 2 8℃时酶活为 5 6 5 9u mL(菌液 ) ,在 5℃时的反应速率仅为 2 8℃时的11 72 % ,相应的表观酶活为 6 6 3u mL(菌液 )。而在丙烯酰胺 45 %浓度条件下的酶活大约只有丙烯酰胺 5 %浓度下的酶活的 1 2。经过对不同温度下的反应速度的研究 ,得到腈水合酶水合反应的活化能为 6 5 5 7kJ·mol- 1 。本文进一步研究了自由细胞状态下 ,菌体浓度、pH值、温度、丙烯腈浓度、丙烯酰胺浓度对腈水合酶失活的影响 ,得到了失活动力学。结果表明 ,在这些因素中 ,对酶失活影响的最主要因素还是温度和丙烯酰胺浓度。尤其当丙烯酰胺浓度到达 35 %时 ,酶活下降得很快 ,在 5 5h后 ,酶活几乎为零。而在丙烯酰胺浓度为 10 %的情况下 ,5 5h的酶活仍然还存在约 5 0 %。试验结果还表明 ,丙烯腈对酶的稳定性的影响很小。经过数据处理 ,得到的 2 8℃的酶失活速率常数为 5℃下的 2 1

一种腈水解酶的高通量筛选方法

水解腈的酶类(腈水解酶或腈水合酶/酰胺酶)在制药行业中生产有机羧酸及其衍生物方面有着广泛的应用,为了获得较多的酶源,建立高通量筛选方法是非常必要的。今利用改进的羟肟酸铁分光光度比色法建立了一种简单、快速、高通量的筛选方法,同时利用产酶菌株Rhodococcus sp.CCZU10-1静息细胞催化反应来进行方法的准确性验证。并且通过与液相色谱法检测结果进行对比,结果表明羟肟酸铁比色法对有机羧酸的检测具有较高的准确性。因此,建立的高通量筛选方法在产腈水解酶微生物筛选及应用方面有很大应用前景。

腈水合酶产生菌发酵条件的优化及其酶学性质研究

通过腈水合酶生产菌Rhodococcus sp.SHZ-1菌株的发酵过程研究,阐明了发酵液pH、葡萄糖含量以及细胞浓度变化与酶活之间的关系。在发酵过程中调节pH以及补加葡萄糖,使酶活从2 294 U/mL增加到5 226 U/mL,提高了1.28倍。腈水合酶的酶学性质研究表明,温度30℃,反应体系在pH中性范围酶活达到最高。该酶对于底物有很强的耐受性,丙烯腈浓度为7.2%时,酶活最高;产物丙烯酰胺浓度过高,则会严重抑制酶的活性。

生物法转化丙烯腈制取丙烯酰胺的研究(Ⅱ)菌种生长、产酶条件及酶反应条件的研究

本文研究了一株腈水合酶产生菌Ｍｉｃｒｏｃｏｃｕｓｓｐ．Ｓ１１５生长、产酶的条件及其所产酶的反应条件。Ｓ１１５在选定的培养基中，于３０℃摇床培养７２ｈ，其生长较好，酶活也较高。在所研究的几种诱导物中，丙腈对产酶的诱导作用最好。本文还研究了培养过程中补腈对产酶的影响以及底物浓度。

一种3-氰基吡啶水解酶产生菌的高通量筛选策略及应用

利用改进的羟肟酸铁分光光度比色法建立了一种简单、快速、高通量的腈水解酶筛选方法。应用该方法从土壤中筛选获得1株具有3-氰基吡啶水解酶活性的菌株CCZU10-1,经16S rDNA序列分析,鉴定该菌为红球菌属Rhodococcus sp.;同时确定了最适反应温度、pH和金属离子添加剂分别为30℃、7.0和Ca2+(0.1 mmol/L)。在最适催化反应条件下,催化转化50 mmol/L烟腈36 h,烟酸的产率可达到93.5%。

腈水合酶交联酶聚集体在生成烟酰胺体系中的应用

采用交联酶聚集体(CLEAs)技术和球化酶技术对来自大肠杆菌的ES-NHT-118腈水合酶进行固定化.利用大分子葡聚糖醛作为交联剂交联腈水合酶,在优化了温度、p H、交联剂用量及交联时间后,腈水合酶CLEAs和球化酶的酶活回收率分别达到49.63%及52.88%.利用扫描电子显微镜对2种固定化酶进行了表征,将固定化酶用于催化3-腈基吡啶转化生成烟酰胺.同游离酶相比,腈水合酶CLEAs和球化酶显示了良好的p H稳定性和热稳定性,对高浓度底物的耐受性也有提升.酶活为4 U/m L,底物终浓度为50 mmol/L时,2种固定化酶在重复使用10次后分别保留了73.45%及61.26%的催化产率.

丙烯腈水合酶反应动力学与酶失活动力学研究

在以丙烯腈为原料,微生物转化生产丙烯酰胺的过程中,酶催化反应是过程的关键。为了了解酶催化的动力学,以自由细胞的酶为催化剂,进行了腈水合酶的反应动力学和失活动力学的研究。首先研究了菌体浓度、温度、pH值、丙烯腈浓度、丙烯酰胺浓度等对腈水合酶催化反应速度的影响。结果表明,在这些因素中,温度和丙烯酰胺浓度是最主要的影响因素。经过对不同温度下的反应速度的研究,得到腈水合酶水合反应的活化能为Ea=60.87kJ/mol,酶失活反应的活化能为89.36kJ/mol。

聚丙烯腈纤维的生物酶表面改性

本文阐述了利用含腈水合酶的粗酶液处理聚丙烯腈纤维 ,使纤维表面的氰基选择性水解为酰胺基 ,从而提高聚丙烯腈纤维的吸湿性。

丙烯酰胺转化菌的分离筛选及其产酶条件(英文)

从腈纶厂污水处理系统的活性污泥中分离和筛选到一株丙烯酰胺转化菌.经初步鉴定,菌株T3属于红球菌属(Rhodococcus sp.).对菌株T3产生腈水合酶的最适条件进行研究,结果表明,该菌株的最适产酶条件为培养基初始pH值7.5,培养温度35℃,培养时间72h,同时加入0.05g/L Co2 +也会明显提高酶活性.在最适产酶条件下,菌株T3培养液的最高比酶活可达128.3U/mg,比优化前提高55.1%.

游离细胞催化法生产丙烯酰胺的菌株改造策略

丙烯酰胺是一种重要的酰胺类化合物,其聚合产物——聚丙烯酰胺被广泛应用于三次采油、水处理、造纸、冶金等领域。以腈水合酶为核心的生物催化法,尤其是游离细胞催化法,具有转化效率高、产物纯度高以及环境友好等优点,是目前丙烯酰胺生产的主要方法;而腈水合酶及其生产菌株的性能在丙烯酰胺生产工艺中起着至关重要的作用。分别从细胞层次和酶层次对常用的生产菌株性能改造策略进行了简介,并重点阐述了目前用于腈水合酶生产菌株改造的基因重组策略。最后介绍了腈水合酶和产酶细胞的协同改造策略及改造效果。其中,通过对产腈水合酶红球菌R.ruber TH在酶和细胞层面的协同改造,重组游离细胞TH8实现了工业规模约500g/L高浓丙烯酰胺的三批次水合制备。

金属离子对红球菌腈水合酶活力的影响

不同金属离子对红球菌(Rhodococcus sp.)TCCC 28001的生长及其腈水合酶的酶活有着不同程度的影响.菌株TCCC 28001产生的腈水合酶是钴型,且Co2+对该腈水合酶诱导激活的最适浓度为10×10-5mol/L.选择酵母粉中含有且含量波动较大的5种金属离子,考察了在添加10×10-5mol/L Co2+诱导激活下,5种金属离子对酶活的影响.结果表明:Fe2+、Mn2+、Mo6+、Cu2+4种金属离子具有促进作用,Zn2+产生轻微抑制作用.6×10-5mol/L Fe2+的促进效果显著,使菌株TCCC 28001的酶活从453.U/mL增加到1.941.U/mL,提高了328%.

腈水合酶催化水合制备丙烯酰胺反应的研究

对腈水合酶催化水合生产丙烯酰胺反应的条件进行了优化,在最佳反应温度和pH下,采用正交实验法考察了丙烯腈含量、菌体浓度、反应时间3因素对腈水合酶催化反应转化率的影响。结果表明,在腈水合酶催化反应中,丙烯腈含量是最主要的影响因素。最佳的反应条件为:303 K,pH 7.5,菌体稀释10倍,丙烯腈体积分数7％,反应时间120 s。在此条件下达到了最高酶活性6 770 μmol／(min·mL),比未优化之前的酶活性增加了30％以上。最后,对腈水合酶进行了催化反应动力学研究,并通过酶稳定性实验表明了酶的高稳定性。

腈水合酶耐底物突变株的筛选及产酶条件优化

采用紫外诱变和梯度平板法筛选出耐底物的突变株,通过单因素实验考察发酵液起始pH值、装液量、发酵周期、接种量对产酶的影响,确定最佳的发酵条件;采用均匀设计实验优化发酵培养基。筛选出一株能耐受4%丙烯腈的腈水合酶产生菌,在最佳产酶条件下,耐底物突变株的腈水合酶酶活达到11.5MU/mL,与优化前相比,酶活提高了49.35%。腈水合酶耐底物突变株的最佳发酵条件为:初始pH 7.0、装液量16%、发酵周期58 h、接种量10%。最佳发酵培养基配方为:ρ(葡萄糖)=26 g/L,ρ(酵母膏)=2 g/L,ρ(尿素)=4 g/L,ρ(谷氨酸钠)=0.5 g/L,ρ(K2HPO4)=0.2 g/L,ρ(KH2PO4)=0.2 g/L,ρ(MgSO4)=0.05 g/L,φ(DXL)=0.5 mL/L。

融合双亲短肽提高腈水合酶的热稳定性研究

腈水合酶（Nitirle hydratase,NHase）催化腈类物质转化为酰胺类物质,目前用于工业生产丙烯酰胺。但在催化过程中释放的热量易导致酶分子失活。研究通过蛋白质融合技术对腈水合酶进行分子改造,提高热稳定性。将2种双亲自组装肽（self-assembling peptides,SAPs）EAK16和ELK16分别融合至恶臭假单胞菌Pseudomonas putida NRRL-18668来源NHase非催化亚基β的N末端,构建出2种融合型NHase：EAK16-NHase和ELK16-NHase。经过表达、纯化后测定酶活力,发现EAK16-NHase和ELK16-NHase的酶活力分别为（426±14）U/mg和（372±12）U/mg,保留野生型酶活力的97%和85%。在50℃条件下孵育0~60 min,每5 min取样后测定残存酶活力,EAK16-NHase和ELK16-NHase酶活力半衰期（T50）分别为35 min和40 min,野生型NHase为20 min。说明融合EAK16和ELK16均能提高NHase的热稳定性。研究表明融合SAPs能在不显著影响酶活力的条件下提高酶的热稳定性。

腈水合酶底物通道入口调控催化活性的关键氨基酸位点的定位与改造

腈水合酶(nitrile hydratase,NHase,EC 4.2.1.84)是一种催化腈类化合物生成酰胺类化合物的金属酶,工业上用于生物法生产丙烯酰胺和烟酰胺。由于腈类的水合反应是放热反应,工业上对腈水合酶的热稳定性较为关注。该实验室此前通过基因挖掘获得了具有高热稳定性的温泉热碱芽孢杆菌(Caldalkalibacillus thermarum TA2.A1)来源的腈水合酶,但其活性与工业生产要求有较大的差距,因此,提高该来源腈水合酶的酶活力具有重要意义。该研究采用分子动力学模拟的方法,通过对β亚基上位于腈水合酶底物通道入口的N47和N181这2个位点进行代表性氨基酸突变,破坏氢键,提高底物通道入口柔性,增强通道入口构象可变性,继而提高酶促反应催化效率。研究得到了最优突变体βN47F,与野生型酶相比,催化丙烯腈的比酶活力提高了2.57倍,且保持了良好的热稳定性,为工业化应用奠定了坚实的基础。

微生物法生产烟酰胺的特点

本文简要介绍了烟酰胺的生产过程,与化学法生产烟酰胺相比,微生物法具有反应条件温和、单耗低、流程简单、产物产率高和纯度高等优点,适宜于工业化生产。

一种兼具腈水合酶活性与硫氰酸水解酶活性的新型腈类降解酶

硫氰酸水解酶(SCNase)是一种主要来自于硫杆菌属的含钴酶,能够催化焦化废水中的主要成分硫氰酸盐降解。它由3个亚基组成,其活性中心存在2个翻译后修饰氧化的半胱氨酸,并且和钴离子形成独特的爪型配位结构。硫氰酸水解酶在序列和机构上都与钴型腈水合酶有很高的相似性,但活性并不互通。通过在公共序列库里搜寻,发现了一种来自玫瑰单胞菌Roseomonas stagni的新基因型的硫氰酸水解酶。该研究表达、纯化并且对这个硫氰酸水解酶(Rose.s SCNase)进行了表征。有趣的是,Rose.s SCNase不但对硫氰酸钾有催化活性,对腈类底物也具有催化活性,这是迄今为止发现的第一个活性互通的天然腈类降解酶。Rose.s SCNase在最适pH和温度下对烟腈的比酶活为(17.8±1.3)U/mg,对丙烯腈的比酶活为(30.6±1.9)U/mg,对硫氰酸钾的比酶活为(13.5±0.9)U/mg。结构比对结果显示,位于Rose.s SCNase底物结合口袋顶部氨基酸的不同可能是其存在活性互通的原因。Rose.s SCNase可能对研究含氰基底物降解方面有巨大的帮助。

基于底物通道工程提升嗜热腈水合酶对烟腈的催化性能

腈水合酶(nitrile hydratase,NHase,EC 4.2.1.84)是一类将腈类化合物经水合反应生产酰胺类化合物的金属酶,工业上用该酶进行生物法生产烟酰胺。由于水合过程放热,工业用酶对其稳定性提出了更高的要求。实验室前期通过基因挖掘获得了一种来源于嗜热菌温泉热碱芽胞杆菌(Caldalkalibacillus thermarum)TA2.A1的腈水合酶基因,但其催化活性不足,难以满足应用需求。该研究基于底物通道工程,将该酶β亚基的第42位甘氨酸突变为赖氨酸后,其催化3-氰基吡啶的比酶活力提高为野生酶的2.5倍,且仍保留较好的稳定性,经5 L发酵罐培养,细胞酶活力达到5539.0 U/mL,具有巨大的应用潜力。

4-氰基吡啶合成异烟酸菌种发酵工艺的研究

简单介绍了一株4-氰基吡啶合成异烟酸的菌种发酵工艺的研究,探究了不同碳源、氮源、诱导剂浓度、金属离子种类及金属离子浓度对发酵产腈水解酶酶活的影响,并对菌种高密度发酵工艺做了一系列优化,优化后的培养基对于该菌产腈水解酶的酶活达到了1076 U/mL,OD600达到了185,酶活对比优化前提高了40%。该菌在催化4-氰基吡啶合成异烟酸行业具有重要意义。