高效液相色谱/串联质谱法测定奶粉中的硝基呋喃代谢物

用高效液相色谱/串联质谱(LC-MS/MS)法同时测定奶粉中呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林和呋喃妥因的代谢物.盐酸水解奶粉中蛋白结合的代谢物,同时加入2-硝基苯甲醛(2-NBA),37℃过夜衍生化.加入硫酸锌,调pH值至7.0后,再加入亚铁氰化钾去除蛋白.后用乙酸乙酯提取,正己烷净化,分析物采用电喷雾电离正离子(ESI+)、多反应监测(MRM)模式检测,内标法定量.在添加浓度0.5～2 μg/kg范围内,内标法回收率为89.5%～110.3%;相对标准偏差(RSD)小于11.3%.5-马啉代甲基-3-氨基-2-恶唑酮(5-methylmorpholino-3-amino-2-oxazolidinone, AMOZ)、3-氨基-2-恶唑酮(3-amino-2-oxazolidinone, AOZ)方法检出限为0.05 μg/kg,氨基脲(semicarbazide, SEM)、1-氨基-乙内酰胺(1-amino-hydantoin, AHD)为0.1 μg/kg.

ELISA方法检测呋喃妥因代谢物1-氨基乙内酰脲

建立了一种检测呋喃妥因代谢物1-氨基乙内酰脲(1-aminohydantoin,AHD)的酶联免疫方法,并对其进行了优化;得到IC50为3.6ng/mL,检测限为0.085ng/mL。此外,检测了与其他类似物的交叉反应率,显示了很好的特异性;并且通过对猪肉样品添加回收率的测定,证明了该方法的准确性。

呋喃妥因代谢物化学发光酶联免疫检测方法的研究

对呋喃妥因代谢物1－氨基乙内酰脲（ AHD）进行半抗原改造，采用活化酯法将半抗原与卵清蛋白（ OVA）偶联为包被原，与标准品竞争AHD单克隆抗体的抗原结合位点，加入辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗，建立了AHD间接竞争化学发光酶联免疫（ CLEIA）检测法，并对化学发光液、包被原与抗体最优稀释度、包被条件、封闭液和竞争时间五项参数进行优化。结果表明：该方法具有良好的特异性， IC50为0．753 ng／mL，在鸡肉组织中的检测限为0．028μg／kg，添加回收率在80．54％～102．64％之间，变异系数均小于10％。与国标中液相色谱－串联质谱法（ LC－MS／MS）和我国出入境行业标准中酶联免疫检测法（ ELISA）相比，不仅降低了检测限，而且操作简便，为动物源性食品中呋喃妥因代谢物的残留提供了准确、便捷的分析检测手段。

呋喃妥因残留代谢物人工抗原的合成与鉴定

利用对醛基苯甲酸对呋喃妥因代谢物1-氨基乙内酰脲(1-Aminohydantoin hydrochloride,AHD)进行衍生化,衍生物1-氨基乙内酰脲-4-羧苯基肟(CPAHD)通过混合酸酐法与牛血清蛋白(bovine serum albumin,BSA)偶联,用紫外扫描(UV)和变性凝胶电泳(SDS-PAGE)对偶联物进行验证。将偶联成功的人工全抗原(CPAHD-BSA)免疫BALB/c小鼠,通过间接酶联免疫吸附法(ELISA)测定小鼠血清抗体效价为1:32 000。用间接竞争ELISA鉴定抗体特性,结果显示:抗体对AHD与对硝基苯甲醛的衍生物(NPAHD)的灵敏度高,IC50为30.63μg/L,特异性好,与CPAHD有部分交叉反应外,与其他3类硝基呋喃类药物及代谢产物无交叉反应(交叉反应率<0.01%)。结果表明,用CPAHD-BSA作免疫原免疫小鼠可诱导产生针对AHD衍生物(NPAHD)的特异性抗体,为进一步制备AHD单克隆抗体和研制快速筛选检测试剂盒奠定了基础。

直接竞争酶联免疫法测定呋喃妥因代谢物

目的建立动物组织中呋喃妥因代谢物1-氨基乙内酰脲的直接竞争酶联免疫(ELISA)检测法,为检测食品中呋喃妥因代谢物残留提供快速检测的方法。方法采用活化酯法制备辣根过氧化物酶标记抗原,并用棋盘法确定酶标抗原和抗体的稀释度,优化反应条件,建立检测呋喃妥因代谢物的直接竞争酶联免疫法,并对其进行方法学评价。结果该方法的线性方程为Y=-34.723X+158.01(r2=0.9922),线性检测范围为0.177~11.508ng/m L,IC50为1.291 ng/m L;猪肉、鸡肉、鱼肉的最低检测限分别为0.115、0.113、0.109μg/kg,加标回收率在82.6%~104.7%之间,批内变异系数在3.6%~9.3%之间,批间变异系数在4.3%~12.4%之间。结论本方法快速准确,适用于动物组织中呋喃妥因代谢物的检测。

呋喃妥因抗原的制备及其在免疫胶体金快速检测中的应用

本研究从优化呋喃妥因代谢物免疫抗原、包被抗原的结构及优化偶联技术角度出发,提高呋喃妥因代谢物抗体的特异性、亲和力,并通过优化样品前处理步骤,最终得到呋喃妥因代谢物胶体金免疫层析试纸条的检测低限为1.0μg/kg,特异性好,稳定性高。

胶体金免疫层析法快速检测水产品中呋喃妥因代谢物残留

采用胶体金免疫层析技术(GICA)测定水产品中的呋喃妥因代谢物残留,并用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)对实验结果进行确证。结果显示,胶体金免疫层析法的检测限为1.0μg/kg,假阳性率不大于5%,假阴性率为0;对实际样本的检测结果与LC-MS/MS法一致。研究表明,胶体金试纸条法操作简便、快速,成本低,为水产品中呋喃妥因代谢物的残留检测提供了快速筛选方法,而LC-MS/MS法灵敏度高,结果准确,适用于阳性样本的确证和精确定量。

胶体金免疫层析法快速检测食品中呋喃妥因及其代谢物残留

本文采用胶体金免疫层析技术测定测定食品中的呋喃妥因及其代谢物残留,结果显示胶体金免疫层析法的检测限为0. 5μg/kg,假阳率不大于5%,假阴率为0,研究表明胶体金试纸条法操作简便、快速、成本低,是食品中呋喃妥因代谢物的残留检测提供了快速筛选方法。

高效液相色谱-串联质谱研究呋喃妥因代谢物在鲫鱼体内的残留消除规律

采用HPLC-MS/MS研究呋喃妥因代谢物1-氨基乙内酰脲(AHD)在鲫鱼体内的残留消除规律。在22±1℃的水温下,模拟自然养殖条件,用质量浓度为100 ng·mL^(-1)的呋喃妥因药浴鲫鱼12 h,停止药浴后,对鲫鱼体内残留的AHD进行测定,并对鲫鱼内脏样品的提取进行除脂优化。研究结果显示,内脏经正己烷除脂后,加标回收率明显升高,为89.5%~110.2%;AHD在鲫鱼体内的残留量随着消除时间的增加呈现降低的趋势,鱼体肌肉中平均消除速率0.012μg·kg^(-1)·h,内脏中的平均消除速率为1.47μg·kg^(-1)·h,内脏的消除速率明显高于肌肉;鲫鱼肌肉和内脏中AHD的残留量分别在144 h和220 h后低于检测限0.25μg·kg^(-1)。

呋喃妥因代谢物AHD单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备呋喃妥因代谢物AHD单克隆抗体,并进行鉴定。方法利用对羧基苯甲醛合成1-氨基乙内酰胺脲(AHD)的衍生物1-氨基乙内酰脲-4-羧苯基肟(4-CPAHD),通过活性脂法将4-CPAHD与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联,获得免疫抗原4-CPAHD-BSA和包被抗原4-CPAHD-OVA,采用紫外分光光度法检测偶联是否成功。将人工合成抗原4-CPAHD-BSA免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术将免疫小鼠脾脏细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合,筛选能稳定产生抗体的细胞株;通过间接ELISA法检测该细胞株分泌的单克隆抗体的效价、邻硝基-PAHD(2-NPAHD)对单克隆抗体的半数抑制浓度(IC50),并分析抗体的特异性。结果偶联后4-CPAHD-BSA的最大吸收峰有较明显的偏移,表明4-CPAHD与BSA偶联成功,平均偶联比为17.4∶1。制备的单克隆抗体的效价为1∶64 000,2-NPAHD对单克隆抗体的IC50为1.45μg/L,单克隆抗体与同类抗生素及其代谢物无交叉反应。结论制备的AHD单克隆抗体各项指标均较好,为呋喃妥因代谢物免疫检测试剂的研发奠定了基础。

胶体金试纸法研究及在硝基呋喃类代谢物应用

目的:通过对胶体金试纸条的研究,并用该方法对硝基呋喃类代谢物残留量中呋喃妥因代谢物(AHD)进行测定。方法:用胶体金试纸法测定牛奶中硝基呋喃类代谢物残留量中呋喃妥因,与ELISA法进行比较。结果:本方法的测定结果与ELISA法检测结果相符,总符合率达100%;另外,两种方法的测定结果经配对t检验,结果差异无显著性(P>0.05);回收率在85%～92%之间,相对标准偏差14.5%。结论:胶体金试纸条法的建立与研究,并在牛奶中硝基呋喃类代谢物呋喃妥因残留量的应用;具有快速、准确、省时、灵敏与简便的特点。