nm23-H1基因逆转人高转移大细胞肺癌细胞L9981转移表型的分子机制

背景与目的:nm23-H1基因已被证明是转移抑制基因,转染野生型nm23-H1基因可以逆转肿瘤的恶性转移表型,但是nm23-H1基因抑制或逆转肺癌转移的分子机制却知之甚少,我们在建立转nm23-H1基因的人高转移大细胞肺癌细胞株L9981-nm23-H1的基础上,进一步探讨nm23-H1基因抑制肺癌转移的分子机制。方法:应用MTT法和改良的Boyden小室法分析转基因前后细胞的体外增殖能力及体外侵袭力的变化,体内实验分析转基因前后细胞在裸鼠体内的成瘤性及肺转移能力的改变,同时应用RT-PCR和Westernblot分别检测各组细胞中转移相关基因β-catenin、E-Cadherin、CD44S、CD44V6、MMP-2、TIMP-1、VEGF、基因mRNA及蛋白表达水平。结果:(1)转基因细胞株L9981-nm23-H1的体外增殖能力[(0%vs.(19.5±2.9)%]、克隆形成能力(10.3±0.7vs.21.7±1.3)及侵袭力显著低于L9981细胞(31.0±3.0vs.151.0±6.3)(P<0.01);(2)nm23-H1基因在裸鼠体内的抑瘤率显著增高(82.6%vs.0%),且转染nm23-H1基因的L9981细胞裸鼠体内移植瘤肺转移显著降低(0%vs.100%)(P<0.01);(3)nm23-H1基因能够上调β-catenin、E-Cadherin、TIMP-1基因mRNA及蛋白表达,下调VEGF、CD44V6和MMP-2基因mRNA及蛋白表达(P<0.01);(4)nm23-H1表达上调CD44S基因mRNA表达(P<0.01),而对其蛋白表达?

nm23-H_1基因对人肺癌细胞中细胞外信号调节激酶活性的影响

目的 探讨肿瘤转移抑制基因nm2 3 H1 对人高转移大细胞肺癌细胞株L9981中细胞外信号调节激酶ERK1/2活性的影响。方法 应用特异性识别总ERK1/2 ( p44 /4 2MAPkinase)和双磷酸化ERK1/2( phospho p44 /4 2MAPkinase)的抗体及蛋白印迹法 (Westernblot) ,检测L9981(缺失nm2 3 H1 基因的原代肺癌细胞株 )、L9981 nm 2 3 H1 (转染了nm 2 3 H1 基因的L9981细胞株 )、L9981 PLXSN (转染了空载体的L9981细胞株 )中总ERK1/2和磷酸化ERK1/2的水平。磷酸化ERK 1/2活性应用非放射性免疫沉淀和Westernblot法以及 p44 /4 2MAPkinase分析试剂盒予以检测。 结果 L9981 nm2 3 H1 细胞株中磷酸化ERK 1/2的水平 ,以及ERK1/2活性均显著低于L9981细胞株和L9981 PLXSN细胞株 (P <0 .0 1) ,L9981和L9981 PLXSN细胞株间磷酸化ERK 1/2水平和ERK 1/2活性比较均无显著性差异 (P >0 .0 5 )。三个细胞株间总ERK1/2水平比较均无显著性差异 (P >0 .0 5 )。结论 nm2 3 H1 基因可明显靶向地抑制人高转移肺癌细胞株L9981中ERK 1/2的转录表达和ERK 1/2的活性。推测nm2 3 H1 基因的作用机制可能与其抑制了MAPK/ERK信号传导通路有关。

nm23-H1基因对Tca8113的转移能力及化疗敏感性影响的实验研究

目的 通过nm2 3_H1的转化及导入Tca81 1 3细胞株 ,建立稳定、高效、低毒的转染方法 ,观察nm2 3_H1对Tca81 1 3细胞株侵袭转移能力的影响。方法 利用基因转化技术 ,制备高纯度的nm2 3_H1真核表达质粒。利用阳离子脂质体介导的转染技术 ,完成转染方法的建立。利用免疫组化技术 ,检测转染前后的nm2 3_H1的蛋白产物核苷二磷酸激酶A (NDPKA)的表达。利用transwell小室和冲刷实验 ,观察转染前后细胞的侵袭、粘附、趋化运动能力的变化。MTT法观察nm2 3_H1对Tca81 1 3化疗敏感性影响。结果 使用重组的pCMV_Neo_Bam真核表达载体 ,将nm2 3_H1转染口腔癌细胞 ,并获得稳定表达。Tca81 1 3细胞株nm2 3_H1基因转染前后表达水平有明显差异 ,转染后Tca81 1 3细胞侵袭、粘附、趋化运动能力均显著降低 ,转染前后Tca81 1 3细胞株对阿霉素 (ADM)、5_氟尿嘧啶 (5_FU)、甲氨喋呤 (MTX)的化疗敏感性无显著差异 ,转染后Tca81 1 3细胞株对顺铂 (CDDP)明显增敏。结论 nm2 3_H1对Tca81 1 3细胞的侵袭转移能力具有显著抑制作用 ,nm2

nm23-H1 基因产物在人鼻咽癌中的表达及其临床意义

目的：ｎｍ２３是一种肿瘤转移抑制基因。它在某些人类肿瘤包括乳腺癌、结肠癌、胃癌、肝癌、膀胱癌等中的表达水平与肿瘤转移呈负相关。本研究检测ｎｍ２３－Ｈ１基因产物在鼻咽癌中的表达，探讨ｎｍ２３－Ｈ１基因的表达与鼻咽癌转移和预后的关系。方法：用ｎｍ２３－Ｈ１单克隆抗体通过免疫组化ＬＳＡＢ法，对９５例鼻咽低分化鳞癌蜡块标本进行研究，用Ｌｏｇｒａｎｋ检验分析ｎｍ２３－Ｈ１基因的表达与鼻咽癌转移、复发和预后的关系。Ｃｏｘ＇ｓ回归模型作多因素预后分析。结果：ｎｍ２３表达阴性组淋巴结转移率（８６．７％）比表达阳性组高（４８．６％，Ｐ＜０．０１），ｎｍ２３表达阴性组放疗后复发、远处转移较表达阳性组高（Ｐ＜０．０５），ｎｍ２３－Ｈ１基因产物的表达与鼻咽癌患者的预后呈正相关（Ｐ＜０．０１）。Ｃｏｘ＇ｓ回归模型多因素分析显示ｎｍ２３－Ｈ１是影响鼻咽癌预后的一个指标（Ｐ＜０．０５）。结论：本研究的结果提示ｎｍ２３－Ｈ１的阴性表达与鼻咽癌的淋巴结转移、复发、远处转移显著相关，ｎｍ２３－Ｈ１可作为预测鼻咽癌预后的一个重要指标。

转移抑制基因nm23-H_1在人非小细胞肺癌中的表达研究

目的探讨ｎｍ２３－Ｈ１基因表达产物的表达水平与肺癌发生、发展和转移的关系。方法应用免疫组织化学法研究人非小细胞肺癌细胞中ｎｍ２３－Ｈ１基因表达产物的表达水平。结果ｎｍ２３－Ｈ１在肺癌组织中的表达水平（５４．０３％）明显低于癌旁正常肺组织（７３．４８％，Ｐ＜０．０１）。有淋巴结转移的原发癌ｎｍ２３－Ｈ１表达水平明显低于无淋巴结转移的原发癌（Ｐ＜０．０１）；转移癌组织表达水平明显低于原发癌组织（Ｐ＜０．０１）；低分化肺癌明显低于中－高分化肺癌（Ｐ＜０．０１）。结论ｎｍ２３－Ｈ１基因可能参与肺癌的发生、发展和转移过程的调控，ｎｍ２３－Ｈ１基因表达水平降低，预示肺癌的转移和预后不良。

抑癌基因nm23-H_1诱导癌细胞凋亡及抗氧化作用的研究

目的 :初步探讨nm2 3 H1基因的抑癌机制。方法 :实验将nm2 3 H1基因转化进入人喉癌细胞Hep 2 ,使其在细胞中稳定表达。使用电镜观察细胞形态学变化 ,并测定抗氧化剂还原型谷胱苷肽 (GSH)浓度。结果 :nm2 3 H1转化的Hep 2细胞有核固缩、核分离等典型的细胞凋亡现象 ,其GSH浓度也有所升高 (16 9% )。结论 :表明nm2 3 H1具有诱导肿瘤细胞凋亡 ,提高肿瘤细胞抗氧化能力的作用。

食管癌中nm23-H_1基因突变与癌转移的关系

目的 探讨人食管癌中nm2 3-H1基因突变与食管癌转移的关系。方法 应用PCR -SSCP方法对 40例食管癌组织中nm2 3-H1基因进行检测。结果 nm2 3-H1基因突变率转移组 (5 5 % )高于非转移组 (10 % ,P <0 .0 5 )。结论 通过nm2

肿瘤转移抑制基因Nm23-H1融合蛋白的表达纯化及其功能的初步研究

目的利用人Nm23-H1基因原核表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化融合蛋白,并对蛋白其活性进行初步分析。方法将重组质粒pET28a-Nm23-H1转化入E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达并鉴定。用金属螯合层析技术进行蛋白纯化,得到Nm23-H1融合蛋白,用SDS-PAGE及Western blot鉴定纯化蛋白,并用RP-HPLC法、电泳迁移率变动分析实验检测Nm23-H1融合蛋白的核苷二磷酸激酶(NDPK)活性及核酸内切酶(AP)修复活性。结果转化溶原菌后能够表达目的蛋白,蛋白表达量高,为可溶性蛋白。Ni2+柱纯化后得到Nm23-H1融合蛋白经SDS-PAGE及Western blot鉴定正确。RP-HPLC法就及电泳迁移率变动分析实验证明所纯化的Nm23-H1融合蛋白具有NDPK活性,不具有AP修复活性,但可以增加APE1蛋白的AP修复活性。结论利用原核表达载体pET28a-Nm23-H1在E.coliBL21(DE3)中高效表达和纯化得到具有NDPK活性,但无AP修复活性的Nm23-H1融合蛋白,此蛋白可以增强APE1蛋白的AP修复活性,共同参与细胞的DNA损伤修复。

nm23-H1基因在口腔鳞癌颈淋巴结转移不同阶段的调控作用

目的 探讨nm2 3_H1基因在口腔鳞癌区域淋巴结转移不同阶段的调控作用及影响。方法 利用免疫组化和WesternBlot技术 ,结合淋巴结转移和原发灶浸润分型的资料 ,分组对照研究nm2 3_H1基因在 2 0 0例口腔鳞癌颈淋巴结转移不同阶段的表达情况。结果 淋巴结转移组nm2 3_H1基因阴性表达率明显高于无淋巴结转移组 (P <0 0 1)。N1期、转移仅累及 1个淋巴结、Ⅳc型浸润 ,以及低分化肿瘤的患者 ,均有比其它患者明显增高的nm2 3_H1基因的阴性表达率 (P <0 0 1) ;转移至颌下或颌下—颈深上淋巴结平面者的阴性表达率 ,也高于转移到其它平面者 (P <0 0 5 )。结论 nm2 3_H1基因主要是通过干扰肿瘤实体内高转移细胞亚群的形成和初始转移的发生来调控口腔鳞癌患者的颈淋巴结转移。

人肺癌组织中nm23-H_1基因突变研究

目的 探讨癌转移抑制基因nm2 3 H1 在人肺癌中的突变情况 ,及其与肺癌发生、发展及转移的关系。方法 采用聚合酶链反应—单链构象多态性技术 (PCR SSCP) ,对手术切除的 45例肺癌组织和 7例正常肺组织的nm2 3 H1 基因的 5个外显子进行突变分析。结果 在所检测的肺组织中 ,未发现nm2 3 H1 基因纯合缺失。SSCP分析发现一例肺癌组织nm2 3 H1 基因外显子 1单链DNA迁移率发生改变。此例患者为晚期肺鳞癌 ,伴有纵隔淋巴结转移和恶性胸水。结论 本实验所检测的nm2 3 H1 基因外显子部分的基因突变在肺癌中发生率低 ,nm2 3 H1

nm23-H1基因转染对人胆管癌细胞系QBC_(939)体外浸润能力的影响

目的 探讨nm2 3 H1基因转染对人胆管癌细胞系QBC939体外浸润能力的影响。方法 将含有全长nm2 3 H1cDNA的真核表达载体通过脂质体法转染人胆管癌细胞系。结果 转染成功的QBC939细胞 ,其nm2 3 H1基因的mRNA、蛋白表达明显增加 ,转染nm2 3 H1基因的胆管癌细胞体外浸润能力下降 ,穿越matrigel的细胞数明显低于亲本QBC939细胞 ,代表浸润能力的Ⅳ型胶原酶(MMP 9)分泌量下降。结论 nm2 3 H1基因可以抑制胆管癌细胞的体外浸润能力。

nm23-H1基因转染L9981肺癌细胞前后基因表达谱的变化

应用基因芯片检测L9981细胞转染nm23-H1基因前后细胞基因表达谱的改变.提取L9981细胞转染nm23-H1基因前后细胞的总RNA,纯化为mRNA后再转录为cDNA.cDNA经限制性内切酶Sau3AI消化后,cDNA片段分别用cy3和cy5标记,与定制的包含14000个基因芯片杂交.杂交结果经扫描和软件分析,nm23-H1基因转染L9981细胞后发现1156(8.26%,1156/14000)个基因表达上调,而642(4.59%,642/14000)个基因表达下调.涉及基因包括信号传导、癌基因与抑癌基因、转移相关基因、细胞周期与凋亡、细胞外基质与细胞骨架相关基因,以及细胞因子和转录因子等.nm23-H1基因是通过对转移相关基因的调节来发挥其抑制肺癌细胞株L9981侵袭和转移作用的.

nm23-H1和p53基因表达与肝细胞癌临床病理学特征的关系

目的：研究ｎｍ２３－Ｈ１和ｐ５３基因表达与肝细胞癌（肝癌）临床病理学特征的关系。方法：采用ＡＢＣ免疫组织化学染色法检测了２９例肝癌标本的ｎｍ２３－Ｈ１和ｐ５３基因表达。结果：ｎｍ２３－Ｈ１基因在肝癌中表达的阴性率为６０％（１８／２９）；ｎｍ２３－Ｈ１基因低表达与门静脉癌栓、肝癌分化程度Ｅｄｍｏｎｄｓｏｎ分级、血清ＡＦＰ水平等显著相关（Ｐ均＜０．０５）；ｐ５３基因表达阳性率为７０％（２０／２９）；ｐ５３基因过表达与肝癌门静脉癌栓、血清ＡＦＰ水平显著相关（Ｐ均＜０．０５）。结论：（１）ｎｍ２３－Ｈ１基因低表达和ｐ５３基因过表达可能与ＡＦＰ基因激活有关；（２）ｎｍ２３－Ｈ１和ｐ５３基因突变可能促进肝癌门静脉转移。

利用定点突变技术构建突变nm23-H_1和EGFP融合基因

背景与目的以前的研究已经证明nm23H1基因是肿瘤转移抑制基因,但其抑制肿瘤转移的分子机制目前还不完全清楚。基因定点突变技术可以精确地改变基因的特定碱基序列,获得突变蛋白质。本研究的目的是应用基因定点突变技术构建突变型nm23H1增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合基因,为进一步研究肿瘤抑制基因nm23H1的功能、生化作用机制提供理论基础和实验依据。方法以逆转录病毒PLXSN野生型nm23H1EGFP质粒为突变模板,应用QuikChangeTM定点突变方法,简单、快速、高效地引入nm23H1S44A、nm23H1P96S、nm23H1H118F、nm23H1S120G四个点突变和一个联合位点突变nm23H1P96SS120G,构建了突变型nm23H1EGFP融合基因。结果成功构建了nm23H1S44AEGFP、nm23H1P96SEGFP、nm23H1H118FEGFP、nm23H1S120GEGFP、nm23H1P96SS120GEGFP五个突变型nm23H1EGFP融合基因,经DNA序列分析突变的碱基序列与实验设计完全一致。结论成功构建了五个具有不同突变位点的突变型nm23H1EGFP融合基因。QuikChangeTM定点突变技术是一种简单、快速、高效的基因定点突变方法。

nm23-H1基因在人肺癌细胞L9981恶性表型逆转中的作用

nm23-H1基因是肿瘤转移抑制基因,转染野生型的nm23-H1基因可以逆转肺癌的恶性表型,我们拟建立转染野生型nm23-H1基因的人大细胞肺癌细胞株L9981-nm23-H1,并初步探讨nm23-H1基因在逆转L9981细胞株恶性表型中的作用。应用基因克隆技术构建质粒载体pLXSN-nm23-H1-EGFP,并建立L9981-nm23-H1细胞株。同时应用Westernblot检测L9981-nm23-H1细胞中nm23-H1蛋白表达。细胞培养及改良的Boyden小室法分别检测L9981-nm23-H1细胞株的体外生物学行为,动物实验检测L9981-nm23-H1细胞株在裸鼠体内的成瘤性及肺部转移能力。结果成功构建了逆转录病毒载体pLXSN-nm23-H1-EGFP;并建立了人大细胞肺癌细胞株L9981-nm23-H1;nm23-H1基因在细胞株L9981-nm23-H1中稳定、高效表达;L9981-nm23-H1细胞体外增殖能力,克隆形成力,体外侵袭力显著降(P<0.01);L9981-nm23-H1裸鼠体内的成瘤性及肺部转移能力显著低于L9981和L9981-pLXSN(P<0.01);nm23-H1基因的抑瘤率82.56%。本研究资料提示转染野生型nm23-H1基因可以逆转人大细胞肺癌细胞株L9981的恶性表型。

nm23-H_1基因与乳腺癌转移和预后的关系及其突变的研究

采用免疫组化染色分析100例乳腺癌组织的nm23－H1基因表达与腋窝淋巴结转移和预后的关系，发现阳性表达者的5年无瘤生存率为84．8％（39／46），明显高于阴性表达者的52．9％（18／34），P＜0．01。进一步对20例采用RNA提取、PT－PCR、PCR－SSCP等方法检测乳腺癌组织中nm23－H1基因mRNA表达和突变情况，发现有突变的乳腺癌其基因表达均为阴性，胶窝淋巴结转移均为阳性（P＝0．036）。研究结果提示：nm23－H1基因突变可能易发生于晚期乳腺癌，同时检测nm23－H1基因mRNA表达水平和突变情况可作为判断乳腺癌（尤其是无淋巴结转移乳腺癌）的一项指标。

人肝癌组织中nm23-H1基因突变的检测及意义

目的观察肿瘤转移抑制基因nm23-H1在人原发性肝细胞癌中的突变情况,探讨nm23-H1基因突变与肝癌发生、发展及转移的关系。方法采用聚合酶链反应-单链构象多态性技术(PCR-SSCP),对16例肝癌组织、12例癌旁组织和4例正常肝组织的nm23-H1基因的第1、2、4外显子突变情况突变进行检测。结果肝癌组织中有1例nm23-H1基因第1外显子纯合缺失;肝癌组织中1例第1外显子、1例第2外显子,癌旁组织中2例第2外显子有单链DNA泳动变位。结论nm23-H1基因突变在肝癌组织中发生率低。

nm23-H_1-绿色荧光蛋白融合基因真核表达载体的构建和表达

目的 :构建包含人野生型nm2 3 H1cDNA和绿色荧光蛋白 (GFP)基因的真核表达载体pLXSN nm2 3 H1 EGFP ,用以研究nm2 3 H1逆转肺癌转移表型的分子机制。 方法 :应用基因工程和分子克隆技术 ,将nm2 3 H1 EGFP基因克隆到真核表达载体pLXSN中 ,得到真核重组载体pLXSN nm2 3 H1 EGFP ;脂质体法转染包装细胞系PA317,得到包含nm2 3 H1 EGFP的逆转录病毒 ,并感染人肺癌细胞株L9981。 结果 :构建了pLXSN nm2 3 H1 EGFP逆转录病毒真核表达载体 ,L9981细胞能够表达nm2 3 H1 EGFP融合蛋白。 结论 :成功构建真核表达载体pLXSN nm2 3 H1 EGFP ,并能在L9981细胞中持续、稳定和高效表达nm2 3 H1 EGFP融合蛋白。

子宫内膜异位症与nm23-H1基因之间关系的研究

目的 研究nm2 3 H1基因在子宫内膜异位症发生中的作用。方法 采用免疫组化方法研究 2 5例子宫内膜异位症患者的病理组织和 2 2例正常子宫内膜组织中的nm2 3 H1蛋白的表达情况 ;用RT PCR方法研究 2 5例子宫内膜异位症患者的病理组织中nm2 3 H1基因的mRNA的表达情况。结果 子宫内膜异位症组中的nm2 3 H1蛋白表达水平明显低于对照组 (P <0 .0 1) ,子宫内膜异位症组中 ,nm2 3 H1蛋白表达与mRNA表达的结果无显著性差异 (P >0 .0 5 )。结论 nm2 3 H1基因在子宫内膜异位症的发生发展中起一定的作用。

nm23-H1基因转染前后人大细胞肺癌细胞株抑制消减cDNA文库的构建

背景与目的已有的研究表明,nm23-H1基因是一个重要的肺癌转移抑制基因,为了筛选与该基因表达相关的差异表达基因,本研究拟构建nm23-H1基因转染前后人大细胞肺癌细胞株(L9981和L9981-nm23-H1)差异表达基因的抑制消减cDNA文库,为进一步筛选、克隆与nm23-H1转移相关的基因奠定基础。方法利用抑制消减杂交(suppressive subtractive hybridization,SSH)技术构建nm23-H1基因转染前后人大细胞肺癌细胞株(L9981和L9981-nm23-H1)间差异表达基因的正向和反向消减cDNA文库,经蓝白菌落筛选克隆,并PCR反应鉴定。结果成功构建了该两株细胞株差异表达基因的正向和反向消减cDNA文库。经蓝白菌落筛选,正向消减文库总共获得约300个白斑克隆,反向消减文库总共获得约400个白斑克隆,从正反向消减文库中各挑选96个克隆进行PCR扩增检测是否有插入片段,结果显示在挑选的正向文库中有84个克隆有插入片段,反向文库中有83个克隆有插入片段,其片段大小范围为(300-750)bp。结论抑制消减杂交是克隆差异表达基因的有效方法,我们应用SSH法和T/A克隆技术成功建立了nm23-H1基因转染前后人大细胞肺癌细胞株(L9981和L9981-nm23-H1)差异表达基因的抑制消减cDNA文库。nm23-H1基因在肺癌细胞中的表达可能影响某些转移相关基因的差异表达。