nm23-H1基因实时荧光定量PCR标准质粒的构建

目的:制备用于nm23-H1基因mRNA实时荧光定量PCR检测的质粒标准品。方法:通过PCR扩增出目的片断,纯化后T-A连接至pMD18-T载体,转化宿主菌E.coliDH5α,获得阳性克隆;通过PCR扩增、双酶切鉴定和测序分析,确认重组质粒完整正确;大量抽提重组质粒,测定其拷贝浓度,10倍稀释成梯度标准品,并进行荧光定量PCR检测分析。结果:nm23-H1基因目的片段成功重组至pMD18-T载体上,获得的重组质粒保持了目的片段的特异性和序列完整性。梯度浓度标准质粒的荧光定量PCR结果显示,循环阈值(C t)与起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系。结论:成功构建了nm23-H1基因实时荧光定量PCR质粒标准品。

nm23-H1基因对人肺腺癌A549细胞增殖和侵袭的抑制作用

目的:研究转染nm23-H1基因对体外培养A549细胞增殖和侵袭的抑制作用及其机理。方法:构建nm23-H1基因的真核表达载体,转染到体外培养的人肺腺癌细胞A549中,通过G418筛选出稳定表达克隆,RT-PCR及免疫组化检测nm23-H1在细胞内的表达情况。绘制细胞生长曲线检测nm23-H1基因对细胞生长的影响,流式细胞仪检测细胞周期,原子力显微镜观察细胞膜表面伪足的超微结构。结果:转染后的肿瘤细胞能稳定表达nm23-H1基因,抑制了肿瘤细胞的增殖。nm23-H1基因没有诱导细胞凋亡但使G1期细胞增加而S期细胞减少,停滞于G0期。转染nm23-H1基因后细胞边缘的伪足减少。结论:nm23-H1基因能抑制体外培养的A549肿瘤细胞的增殖,可能通过改变细胞表面结构减弱细胞的侵袭能力。

nm23-H_1基因在急性白血病中表达及与多药耐药关系

①目的 检测急性白血病病人nm23- H1 基因表达,探讨其与病人预后和多药耐药的关系。②方法采用半定量逆转录聚合酶链反应(RT PCR)技术,检测46 例初诊急性白血病病人及15 例正常对照组骨髓细胞nm23 H1 表达,同时检测其多药耐药基因MDR1及MRP表达。③结果 正常骨髓细胞nm23 H1 表达阴性;46 例急性白血病病人中,43例有nm23- H1 表达,且其表达水平与MDR1 及MRP 表达水平无明显相关性(r= 0.39、0.21,P>0.05)。④结论 nm23 -H1 高表达与急性白血病发生有关,但与MDR1及MRP基因的表达无关。