利用定点突变技术构建突变nm23-H_1和EGFP融合基因

背景与目的以前的研究已经证明nm23H1基因是肿瘤转移抑制基因,但其抑制肿瘤转移的分子机制目前还不完全清楚。基因定点突变技术可以精确地改变基因的特定碱基序列,获得突变蛋白质。本研究的目的是应用基因定点突变技术构建突变型nm23H1增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合基因,为进一步研究肿瘤抑制基因nm23H1的功能、生化作用机制提供理论基础和实验依据。方法以逆转录病毒PLXSN野生型nm23H1EGFP质粒为突变模板,应用QuikChangeTM定点突变方法,简单、快速、高效地引入nm23H1S44A、nm23H1P96S、nm23H1H118F、nm23H1S120G四个点突变和一个联合位点突变nm23H1P96SS120G,构建了突变型nm23H1EGFP融合基因。结果成功构建了nm23H1S44AEGFP、nm23H1P96SEGFP、nm23H1H118FEGFP、nm23H1S120GEGFP、nm23H1P96SS120GEGFP五个突变型nm23H1EGFP融合基因,经DNA序列分析突变的碱基序列与实验设计完全一致。结论成功构建了五个具有不同突变位点的突变型nm23H1EGFP融合基因。QuikChangeTM定点突变技术是一种简单、快速、高效的基因定点突变方法。

转移抑制基因nm23-H_1在人非小细胞肺癌中的表达研究

目的探讨ｎｍ２３－Ｈ１基因表达产物的表达水平与肺癌发生、发展和转移的关系。方法应用免疫组织化学法研究人非小细胞肺癌细胞中ｎｍ２３－Ｈ１基因表达产物的表达水平。结果ｎｍ２３－Ｈ１在肺癌组织中的表达水平（５４．０３％）明显低于癌旁正常肺组织（７３．４８％，Ｐ＜０．０１）。有淋巴结转移的原发癌ｎｍ２３－Ｈ１表达水平明显低于无淋巴结转移的原发癌（Ｐ＜０．０１）；转移癌组织表达水平明显低于原发癌组织（Ｐ＜０．０１）；低分化肺癌明显低于中－高分化肺癌（Ｐ＜０．０１）。结论ｎｍ２３－Ｈ１基因可能参与肺癌的发生、发展和转移过程的调控，ｎｍ２３－Ｈ１基因表达水平降低，预示肺癌的转移和预后不良。

nm23-H_1基因对人肺癌细胞中细胞外信号调节激酶活性的影响

目的 探讨肿瘤转移抑制基因nm2 3 H1 对人高转移大细胞肺癌细胞株L9981中细胞外信号调节激酶ERK1/2活性的影响。方法 应用特异性识别总ERK1/2 ( p44 /4 2MAPkinase)和双磷酸化ERK1/2( phospho p44 /4 2MAPkinase)的抗体及蛋白印迹法 (Westernblot) ,检测L9981(缺失nm2 3 H1 基因的原代肺癌细胞株 )、L9981 nm 2 3 H1 (转染了nm 2 3 H1 基因的L9981细胞株 )、L9981 PLXSN (转染了空载体的L9981细胞株 )中总ERK1/2和磷酸化ERK1/2的水平。磷酸化ERK 1/2活性应用非放射性免疫沉淀和Westernblot法以及 p44 /4 2MAPkinase分析试剂盒予以检测。 结果 L9981 nm2 3 H1 细胞株中磷酸化ERK 1/2的水平 ,以及ERK1/2活性均显著低于L9981细胞株和L9981 PLXSN细胞株 (P <0 .0 1) ,L9981和L9981 PLXSN细胞株间磷酸化ERK 1/2水平和ERK 1/2活性比较均无显著性差异 (P >0 .0 5 )。三个细胞株间总ERK1/2水平比较均无显著性差异 (P >0 .0 5 )。结论 nm2 3 H1 基因可明显靶向地抑制人高转移肺癌细胞株L9981中ERK 1/2的转录表达和ERK 1/2的活性。推测nm2 3 H1 基因的作用机制可能与其抑制了MAPK/ERK信号传导通路有关。

抑癌基因nm23-H_1诱导癌细胞凋亡及抗氧化作用的研究

目的 :初步探讨nm2 3 H1基因的抑癌机制。方法 :实验将nm2 3 H1基因转化进入人喉癌细胞Hep 2 ,使其在细胞中稳定表达。使用电镜观察细胞形态学变化 ,并测定抗氧化剂还原型谷胱苷肽 (GSH)浓度。结果 :nm2 3 H1转化的Hep 2细胞有核固缩、核分离等典型的细胞凋亡现象 ,其GSH浓度也有所升高 (16 9% )。结论 :表明nm2 3 H1具有诱导肿瘤细胞凋亡 ,提高肿瘤细胞抗氧化能力的作用。

肿瘤转移抑制基因nm_(23)-H_1在口腔粘膜鳞癌和癌前病变中的表达及意义

目的 :通过观察肿瘤转移抑制基因nm2 3 -H1在正常口腔粘膜 (NM)、口腔粘膜白斑 (LK)及口腔粘膜鳞癌 (OSCC)中的不同表达 ,分析其在OSCC及其癌变过程中的表达规律 ,探讨其与肿瘤的分化、浸润和转移的关系。方法 :采用免疫组织化学SP法检测nm2 3 -H1在 8例NM、12例LK及 5 8例OSCC中的不同表达 ,用x2 检验Fisher精确概率法对检测结果进行统计学分析。结果 :nm2 3 -H1在NM及LK中多数为高染 ,分别占 87 2 5 %和 83 3% ,而在OSCC中低染率为 5 6 90 % ,与前两者相比存在着显著差异 (p<0 0 5 ) ;nm2 3 H1的异常表达与肿瘤的分化程度及有无颈淋巴结转移 ,都存在显著相关性 (p <0 0 5 )。结论 :nm2 3 -H1蛋白表达水平是判断肿瘤有无颈淋巴结转移及其分化程度的参考指标。

人肺癌细胞株L9981-nm23-H_1的建立

目的 建立转染野生型nm2 3 H1 基因的人大细胞肺癌细胞株L9981 nm2 3 H1 。方法 应用基因克隆技术构建逆转录病毒载体pLXSN nm 2 3 H1 EGFP。脂质体法转染PA3 17细胞 ,得到逆转录病毒 ,并将病毒感染L9981细胞 ,获得L9981 nm 2 3 H1 。应用PCR和Westernblot检测L9981 nm2 3 H1 细胞中nm2 3 H1基因及其蛋白表达。结果 成功构建了逆转录病毒载体pLXSN nm2 3 H1 EGFP。nm2 3 H1 cDNA导入到L9981细胞株中 ,并检测到L9981 nm 2 3 H1 细胞中有nm 2 3 H1 蛋白表达。结论 nm 2 3 H1 基因在细胞株L9981 nm2 3 H1 中能持续。

大肠癌组织nm23-H_1、MMP-9蛋白表达及其意义

目的 探讨大肠癌nm 23 H1、MMP- 9基因蛋白的表达及其意义。方法 用免疫组化 SABC方法检测 60 例大肠癌和15例大肠息肉nm 23 H1、MMP- 9蛋白的表达。结果 大肠癌nm 23 H1 蛋白阳性表达率与大肠癌 Dukes分期、组织分化程度、年龄及有无局部淋巴结转移密切相关(P<0.05);与大肠息肉相比,大肠癌 MMP -9 蛋白表达明显增高,MMP -9表达还与组织分化程度、Dukes分期、有无淋巴结及肝脏转移相关(P<0.05);两者在大肠癌中的表达存在相关性(P<0.05)。结论 MMP- 9 蛋白表达的检测有助于区分大肠良恶性肿瘤;MMP- 9 和 nm 23 H1 蛋白表达与大肠癌Dukes分期、组织分化程度、有无局部淋巴结转移密切相关,可作为判断大肠癌患者转移复发的参考指标。

120例胃癌中p16,nm23-H_1基因蛋白表达与临床预后的关系

应用LSAB免疫组化法对120例胃癌组织中P16，nm23-H1基因蛋白测定，结果发现P16和nm23-H1阳性表达率分别为48．3％、29．2％，二者共同阳性为22．5％。P16，nm23-H1在早期癌、高分化腺癌、粘膜内癌和无淋巴结转移组阳性率明显高于其它各型（P＜0．05）。P16，nm23-H1阳性病例存活率明显高于阴性病例（P＜0．01）。P16，nm23-H1阳性病例存活率明显高于阴性病例（P＜0．01）。结果提示P16，nm23-H在胃癌中的阳性表达对抑制肿瘤生长、浸润和转移起了重要作用．可作为胃癌患者预测转移和预后的指标。

人肺癌组织中nm23-H_1基因突变研究

目的 探讨癌转移抑制基因nm2 3 H1 在人肺癌中的突变情况 ,及其与肺癌发生、发展及转移的关系。方法 采用聚合酶链反应—单链构象多态性技术 (PCR SSCP) ,对手术切除的 45例肺癌组织和 7例正常肺组织的nm2 3 H1 基因的 5个外显子进行突变分析。结果 在所检测的肺组织中 ,未发现nm2 3 H1 基因纯合缺失。SSCP分析发现一例肺癌组织nm2 3 H1 基因外显子 1单链DNA迁移率发生改变。此例患者为晚期肺鳞癌 ,伴有纵隔淋巴结转移和恶性胸水。结论 本实验所检测的nm2 3 H1 基因外显子部分的基因突变在肺癌中发生率低 ,nm2 3 H1

食管癌中nm23-H_1基因突变与癌转移的关系

目的 探讨人食管癌中nm2 3-H1基因突变与食管癌转移的关系。方法 应用PCR -SSCP方法对 40例食管癌组织中nm2 3-H1基因进行检测。结果 nm2 3-H1基因突变率转移组 (5 5 % )高于非转移组 (10 % ,P <0 .0 5 )。结论 通过nm2

c-erbB-2、p53、bcl-2和nm23-H_1在肺癌中的表达

目的：探讨ｃｅｒｂＢ２、ｐ５３、ｂｃｌ２和ｎｍ２３Ｈ１基因在肺癌发生发展过程中的作用。方法：用免疫组化ＡＢＣ法对原发性肺癌组织中４种基因的表达和突变进行检测。结果：５８例肺癌中，３１例（５３４５％）ｐ５３过度表达，１８例（３１０３％）ｂｃｌ２过度表达。ｃｅｒｂＢ２与ｎｍ２３Ｈ１在１０例小细胞肺癌（ＳＣＬＣ）中未见表达。而在４８例非小细胞肺癌（ＮＳＣＬＣｓ）中两者过度表达率均为５０％。ｃｅｒｂＢ２与ｎｍ２３Ｈ１表达呈正相关（Ｐ＜００５）。腺癌ｎｍ２３Ｈ１的表达明显高于鳞癌（Ｐ＜００５）。ｐ５３、ｂｃｌ２蛋白表达在肺癌分化程度中呈负相关（Ｐ＜００５）。ｎｍ２３Ｈ１、ｐ５３和ｂｃｌ２的表达与患者的生存率有关（Ｐ＜００５）。结论：ｃｅｒｂＢ２、ｐ５３、ｂｃｌ２和ｎｍ２３Ｈ１基因蛋白产物的检测对肺癌患者的诊治和预后评估有积极意义。

nm23-H_1mRNA表达与肾母细胞瘤临床行为的关系

应用Northernblot分子杂交技术，检测30例肾母细胞瘤及其对应正常肾组织中nm23－H1mRNA表达。通过nm23－H1mRNA水平的比较及其与临床病理的分析，发现肾母细胞瘤nm23－H1mRNA呈低表达，随着病程的演进和转移的出现，肿瘤细胞中nm23－H1mRNA表达水平呈显著性降低，与肿瘤的病理类型无显著相关性（P＞0．05）。提示nm23－H1RNA低表达可能是肾母细胞瘤演进和转移的重要因素。

nm23-H_1肿瘤转移抑制基因在肝细胞癌中的表达及其临床意义

目的：研究ｎｍ２３－Ｈ１基因在肝癌中的表达。方法：应用免疫组化方法对１０４例肝细胞癌组织进行了ｎｍ２３－Ｈ１基因蛋白产物的检测，并结合术后随访资料分析了ｎｍ２３－Ｈ１的表达与患者预后的关系。结果：肝癌组织中ｎｍ２３－Ｈ１阳性产物主要表达在细胞浆内，阳性表达率为５１．９２％（５４／１０４）。ｎｍ２３－Ｈ１蛋白的表达与癌旁伴肝硬化病变以及肝细胞癌的侵袭生长和门静脉癌栓转移呈负相关。值得注意的是，ｎｍ２３－Ｈ１基因在肝癌切除术后无瘤生存期大于５～１０年以上病例中的阳性表达率高达８０％（２４／３０），而在术后１２～３２个月复发病例中的阳性表达率仅占２６．０９％（１２／４６）。结论：ｎｍ２３－Ｈ１低表达与癌肿复发密切相关，高表达是患者术后长期生存的一个重要因素。临床开展ｎｍ２３－Ｈ１基因的检测，对癌肿转移的早期诊断、确定合理治疗方案、提高治疗效果具有重要意义。

nm23-H_1蛋白表达与卵巢癌分级分期及转移预后的关系

了解卵巢肿瘤中转移抑制基因ｎｍ２３－Ｈ１的表达情况及其与卵巢癌分级分期、转移预后的关系。应用免疫组化ＡＢＣ方法检测１０３例卵巢癌、８例交界性卵巢肿瘤、３２例良性肿瘤及３０例正常卵巢的ｎｍ２３－Ｈ１蛋白表达，并分析了ｎｍ２３－Ｈ１表达与卵巢癌临床病理学的关系。１）在恶性、交界性和良性卵巢肿瘤及正常卵巢中ｎｍ２３－Ｈ１的表达率分别为７０．９％、６２．５％、５０％和２０％；恶性组与良性组及正常对照组相比有明显统计学差异；２）ｎｍ２３－Ｈ１表达与卵巢癌的组织类型、残存癌灶大小及治疗情况无明显关系，与淋巴结转移及预后相关不显著；而与分级分期明显相关，分化较差、期别较晚的卵巢癌患者的ｎｍ２３－Ｈ１表达明显降低。ｎｍ２３－Ｈ１基因在卵巢肿瘤的发生中起着重要作用。

nm23-H_1-绿色荧光蛋白融合基因真核表达载体的构建和表达

目的 :构建包含人野生型nm2 3 H1cDNA和绿色荧光蛋白 (GFP)基因的真核表达载体pLXSN nm2 3 H1 EGFP ,用以研究nm2 3 H1逆转肺癌转移表型的分子机制。 方法 :应用基因工程和分子克隆技术 ,将nm2 3 H1 EGFP基因克隆到真核表达载体pLXSN中 ,得到真核重组载体pLXSN nm2 3 H1 EGFP ;脂质体法转染包装细胞系PA317,得到包含nm2 3 H1 EGFP的逆转录病毒 ,并感染人肺癌细胞株L9981。 结果 :构建了pLXSN nm2 3 H1 EGFP逆转录病毒真核表达载体 ,L9981细胞能够表达nm2 3 H1 EGFP融合蛋白。 结论 :成功构建真核表达载体pLXSN nm2 3 H1 EGFP ,并能在L9981细胞中持续、稳定和高效表达nm2 3 H1 EGFP融合蛋白。

甲状腺乳头状腺癌中EGFR、nm23-H_1和p53蛋白的表达

目的：探讨 Ｅ Ｇ Ｆ Ｒ、ｎｍ２３ Ｈ１ 及ｐ５３ 蛋白在甲状腺乳头状腺癌中的表达及其与淋巴结转移的关系。方法：应用免疫组化 Ａ Ｂ Ｃ 法检测３６ 例有颈淋巴结转移的甲状腺乳头状腺癌的原发灶与转移灶和４０ 例无转移的甲状腺乳头状腺癌中 Ｅ Ｇ Ｆ Ｒ、ｎｍ２３ Ｈ１ 及ｐ５３ 蛋白的表达。结果：７６ 例甲状腺乳头状腺癌的 Ｅ Ｇ Ｆ Ｒ、ｎｍ２３ Ｈ１ 及ｐ５３ 蛋白的阳性表达率分别为５５３ ％ 、６０５ ％ 和１１８ ％ ；但有转移的甲状腺乳头状腺癌的 Ｅ Ｇ Ｆ Ｒ 阳性表达率高于无转移者（ Ｐ＜ ００５） ，且转移灶的 Ｅ Ｇ Ｆ Ｒ 阳性率明显高于其原发灶（ Ｐ＜ ００５） ；有转移的甲状腺乳头状腺癌的ｎ ｍ２３ Ｈ１ 阳性率低于无转移癌者（ Ｐ＜ ００１） ；甲状腺乳头状腺癌中 Ｅ Ｇ Ｆ Ｒ 的阳性表达与ｎ ｍ２３ Ｈ１ 的表达有负相关（ Ｐ＜ ００１） 。结论：甲状腺乳头状腺癌 Ｅ Ｇ Ｆ Ｒ 的过表达，ｎｍ２３ Ｈ１ 的低表达，二者表达的失平衡是其易于淋巴结转移的原因之一， Ｅ Ｇ Ｆ Ｒ，ｎｍ２３ Ｈ１ 联用可作为甲状腺乳头状腺癌淋巴结转移的评价指标。

肝外胆管癌nm23-H_1和VEGF的表达及其临床意义

应用免疫组化法检测 3 3例肝外胆管癌标本nm 2 3 H1 和VEGF基因的表达 ,并结合临床病理学特征进行分析。结果示 :( 1)nm 2 3 H1 及VEGF的阳性表达率分别为 3 3 .3 %和 72 .7% ;( 2 )nm 2 3 H1 的表达与肿瘤转移无关 ,而VEGF的阳性表达率在有转移组 ( 85 .1% )中明显高于无转移组( 16.7% ) ;( 3 )在行根治手术的肝外胆管癌中nm 2 3 H1 的阳性表达率及VEGF的阴性表达率显著高于行姑息手术者。提示 :( 1)nm 2 3 H1 主要与肿瘤的浸润生长有关 ,而VEGF则是主要与肿瘤的转移有关 ,两者均为独立作用因素 ;( 2 )两者的表达情况可影响手术方式的选择。

nm23-H_1基因转染能上调人肺癌细胞株L9981中GSK-3β激酶活性

目的 探讨转移抑制基因nm2 3 H1对人高转移大细胞肺癌细胞株L9981中Wnt信号传导激酶GSK 3 β的表达量和活性的影响 ,为全面阐明nm2 3 H1基因调控肺癌转移相关信号传导通路的分子机制提供实验依据。方法 将稳定转染nm 2 3 H1基因的人高转移大细胞肺癌细胞株L9981 nm2 3 H1、原代细胞株L9981和空载体转染细胞株L9981 pLXSN培养传代 ,应用Westernblot分别检测应用 2 0mmol/LLiCl处理前后三个肺癌细胞株胞浆、胞核中GSK 3 β的表达水平 ,应用免疫共沉淀同位素闪烁计数法测定上述肺癌细胞株胞浆和胞核中的GSK 3 β激酶活性。 结果 ( 1)L9981 nm2 3 H1胞浆和胞核中GSK 3 β蛋白表达量分别为( 63 41± 5 41)和 ( 4 3 5 6± 490 )IOD ,L9981 pLXSN分别为 ( 3 613± 3 83 )和 ( 70 5± 75 )IOD ,L9981分别为 ( 373 6± 2 98)和 ( 65 7± 5 7)IOD。三个细胞株间胞浆和胞核中GSK 3 β表达量均有非常显著差异 (P <0 .0 1) ;两两比较 :L9981 nm2 3 H1胞浆和胞核GSK 3 β表达水平均显著高于L9981 pLXSN和L9981(P <0 .0 1) ,而后两者之间比较均无显著性差异 (P >0 .0 5 )。 ( 2 )L9981 nm2 3 H1胞浆和胞核GSK 3 β激酶活性分别为 ( 2 895 5±2 5 0 9)和 ( 92 47± 92 4)CPM ,L9981 pLXSN分别为 ( 112 41±

nm23-H_1和CD_(44)蛋白在鼻咽癌中的表达及其与临床的关系

目的 :探讨鼻咽癌 (NPC)中nm2 3-H1和CD4 4的表达及其与临床的关系。方法 :收集NPC蜡块标本 ,应用免疫组化LSAB法 ,检测nm2 3-H1和CD4 4基因蛋白的表达 ,其中前者 48例 ,后者 40例 ,37例同时进行了上述两种检测 ,将两种基因蛋白表达结果与其临床的关系进行研究分析。结果 :nm2 3-H1阳性表达率 6 0 42 % ,其与颈淋巴结转移无关 ,但与转移之颈淋巴结大小有关 ;nm2 3-H1的表达与放疗后鼻咽局部复发无关 ,但表达阳性组远处转移率低于表达阴性组 (P <0 0 5 ) ,并且表达阳性组存活率高于表达阴性组 (P =0 0 0 0 6 7)。CD4 4阳性表达率42 5 % ,与NPC临床情况无相关性。在NPC中 ,nm2 3-H1和CD4 4的表达无相关关系 (P >0 0 5 )。结论 :nm2 3-H1可作为判断NPC远处转移和预后的重要指标。