无乳链球菌nrdD基因缺失株的构建及其对小鼠的致病性检测

为研究nrdD基因对无乳链球菌毒力的影响,本研究参照GenBank中无乳链球菌GD201008-001(登录号:NC_018646)的nrdD全基因序列设计引物,采用融合PCR的方法将nrdD基因上、下游同源臂连接到一起,构建nrdD基因上、下游同源臂融合片段,连接至温敏型自杀质粒pSET4s。PCR克隆含有启动子序列的nrdD基因,连接至链球菌-大肠杆菌穿梭质粒pSET2。分别构建nrdD基因的缺失株ΔnrdD及互补株CΔnrdD。经PCR和基因测序,证明nrdD基因的缺失株及互补株构建成功。通过对ΔnrdD和CΔnrdD的形态学变化的观察,生长速率、小鼠血清中增殖能力、小鼠组织载量的测定以及小鼠攻毒试验的分析,评价nrdD基因对无乳链球菌毒力的影响。结果表明:与野生株GD201008-001相比,ΔnrdD在细菌染色形态上链长明显增加,但不影响荚膜的形成;在相同培养条件下,ΔnrdD在与GD201008-001生长速率无明显差异;在小鼠血清中增殖试验中,ΔnrdD在血清中的增殖能力较野生株明显减缓;在小鼠感染14 h后,ΔnrdD在其血液、脾脏及脑部的载量明显低于野生株,而CΔnrdD在各组织中的载量与野生株相比差异不显著;小鼠的攻毒试验显示,ΔnrdD注射组小鼠存活时间较野生株与互补株延长,差异显著。研究证明,nrdD基因与无乳链球菌毒力密切相关,本试验结果也为深入研究无乳链球菌nrdD基因的功能奠定了基础。

副结核分枝杆菌PanCD基因缺失株的构建及毒力评价

为了开发出能有效防控副结核病的减毒疫苗,试验采用同源重组的方法构建MAP K-10ΔPanCD基因缺失菌株,以MAP K-10菌株基因组为模板,扩增PanCD基因的上下游同源臂,构建pHAE159-p0004s-PanCD重组质粒,转化入耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis,Msg)感受态细胞中获得噬菌体,并感染MAP K-10菌株,然后挑取单克隆扩大培养,提取基因组进行PCR鉴定;绘制MAP K-10菌株与MAP K-10ΔPanCD基因缺失菌株的生长曲线;用MAP K-10ΔPanCD基因缺失菌株感染小鼠并评价其毒力,解剖取肝脏和脾脏,分析组织荷菌量和肝脏病理变化。结果表明:成功扩增出PanCD基因的上下游同源臂,经PCR扩增和酶切鉴定成功构建出pHAE159-p0004s-PanCD重组质粒,将重组质粒电转化入Msg感受态细胞中获得噬菌体,感染MAP K-10菌株后成功构建出MAP K-10ΔPanCD基因缺失菌株;与MAP K-10菌株相比,MAP K-10ΔPanCD基因缺失菌株的生长速率明显下降;攻菌2周时,MAP K-10ΔPanCD基因缺失菌株感染小鼠的肝脏和脾脏中荷菌量显著减少;小鼠肝脏病变明显减轻。说明PanCD基因是MAP的一个重要毒力因子,构建的MAP K-10ΔPanCD基因缺失菌株可作为MAP减毒活疫苗的候选菌株。

副猪嗜血杆菌血清7型crp基因缺失株的部分生物学特性

副猪嗜血杆菌(HPS)是引起猪格拉瑟病(Glasser’s disease)的病原菌,给全球和中国规模化养猪业造成了重大经济损失。副猪嗜血杆菌血清型众多,其中血清7型是近年来分离比例越来越高的血清型,也是危害越来越严重的血清型。crp是最重要的系统调控因子之一,在细菌感染过程中对细菌适应环境变化起着至关重要的作用。为了筛选副猪嗜血杆菌血清7型crp基因缺失弱毒株,采用自然转化法构建了副猪嗜血杆菌血清7型临床分离株HPS7的crp基因缺失株,对HPS7及其crp基因缺失株的生长特性、生物膜形成、抗药性、毒力等进行了研究。结果表明,HPS7的crp基因缺失后,生长显著减慢,自凝速度减慢,生物膜形成能力明显减弱,对大部分抗生素的抗性降低,对豚鼠的毒力降低。以上结果说明crp基因对HPS7的生长、抗药性、毒力均有明显影响。本研究结果为筛选副猪嗜血杆菌血清7型弱毒株提供了参考。

布鲁菌gntR4基因无痕缺失株构建及其生物学特性分析

布鲁菌是兼性胞内寄生菌,其入侵宿主细胞后的胞内存活能力决定着布鲁菌的毒力,布鲁菌毒力因子功能的研究对阐明其致病机制具有重要意义。在前期研究中利用转座子随机突变技术发现转录调控子GntR4与布鲁菌毒力相关,故进一步通过定向缺失方法构建布鲁菌gntR4基因无痕缺失株,并通过耐受性试验、免疫印迹试验、胞内存活试验、小鼠致病性试验等对gntR4缺失株的基本生物学特性进行评估。结果表明:gntR4缺失显著减弱布鲁菌抵抗阳性杀菌肽的能力,说明GntR4可能调控部分基因帮助布鲁菌抵抗宿主非特异性免疫杀伤。但GntR4与T4SS的表达无关,与布鲁菌在胞内的存活能力及对小鼠的致病力无关。综上,这一研究构建的基因无痕缺失方法为布鲁菌基因功能研究奠定基础,针对GntR4调控子的研究完善了GntR调控子家族的功能研究,为阐明布鲁菌抵抗宿主免疫杀伤与建立慢性感染机制间的关系提供依据。

鼠伤寒沙门菌cpxR和acrB双基因缺失菌株的构建及其对抗菌药物敏感性分析

为了探索cpxR基因对鼠伤寒沙门菌多重耐药性的调控机制,同时避免外排泵acrB的存在掩盖cpxR对其他外排泵或外膜蛋白的调控作用,利用基于Red同源重组系统的一步法失活染色体基因,用含有同源臂的线性打靶DNA片段替换目的基因,构建鼠伤寒沙门菌JS株的acrB基因缺失株JSΔacrB。然后利用噬菌体转导技术,以前期构建的cpxR缺失株JSΔcpxR∷kan为供体菌,本研究新构建的JSΔacrB为受体菌,在P22噬菌体的作用下构建双基因缺失菌株JSΔacrBΔcpxR∷kan,同时制备cpxR基因回补菌株JSΔacrBΔcpxR∷kan/pcpxR。最后用微量稀释法测定10种临床常用代表性抗菌药物对JS和各缺失株的最小抑菌浓度(MIC)。结果表明,成功构建鼠伤寒沙门菌的双基因缺失菌株JSΔacrBΔcpxR∷kan以及其cpxR基因互补菌株JSΔacrBΔcpxR/pcpxR。MIC结果显示,acrB基因缺失后,多西环素、庆大霉素、阿米卡星、环丙沙星、恩诺沙星、氟苯尼考、头孢曲松和头孢噻呋的MIC值分别降低32、4、4、16、32、4、2和128倍;双基因缺失后,多西环素、庆大霉素、阿米卡星和头孢噻呋的MIC值进一步降低2、8、2和2倍;而将cpxR基因回补之后,这4种抗菌药物的MIC值会升高4、16、2和4倍。结果表明,cpxR能调控鼠伤寒沙门菌对多西环素、庆大霉素、阿米卡星和头孢噻呋的敏感性。

肠炎沙门菌icdA基因缺失株的构建及重要特性分析

为研究肠炎沙门菌异柠檬酸脱氢酶(IDH)的功能,本研究利用λ-Red重组技术构建了肠炎沙门菌IDH编码基因icdA缺失突变株c50336ΔicdA,对其进行生长和生化特性检测,并通过体外模拟应激试验、药敏试验、生物被膜检测、抗蛋清杀伤、胞内存活和动物感染实验,分析icdA基因在肠炎沙门菌致病机制中的重要作用。研究结果显示,icdA基因缺失不影响肠炎沙门菌的生长特性和生化特性,在热应激(42℃)、酸应激(pH3.5)和高渗应激(NaCl2.4mol/L)条件下其存活率也未出现显著变化,但icdA基因缺失能够显著降低肠炎沙门菌对碱、低渗透压和过氧化氢应激的抵御能力,降低肠炎沙门菌对多粘菌素B的耐药性和生物被膜的形成能力;同时,该基因缺失能够降低肠炎沙门菌对蛋清杀伤的防御能力、在巨噬细胞内的存活能力和其对小鼠的毒力。研究结果表明icdA基因参与肠炎沙门菌的抗应激能力、耐药性、生物被膜形成和抗蛋清杀伤能力,从而影响细菌的毒力。本研究为肠炎沙门菌疫苗的研究奠定了重要基础。

胸膜肺炎放线杆菌relA基因缺失株的构建及其生物学特性的研究

为探究信号分子4或5磷酸鸟苷[(p)ppGpp]对胸膜肺炎放线杆菌(APP)适应性及致病性影响,本研究以APP血清7型S8为亲本株,通过同源重组、卡那抗性及蔗糖负向筛选的方法,将(p)ppGpp的合成调控基因relA敲除,构建缺失突变株S8△relA。生物学特性鉴定结果表明,S8△relA具有良好的遗传稳定性,与亲本株增殖速度变化差异不显著,但平台期营养限制环境下,S8△relA存活能力降低,而且在Gly、Ile、Val营养缺失时,S8△rel生长能力显著抑制;S8△relA的持留菌形成能力、生物膜形成能力以及体外抗肺泡巨噬细胞(PAM)吞噬能力均有不同程度降低;对小鼠致病性试验结果显示,S8△relA相比亲本株S8毒力降低2.7倍。研究结果表明(p)ppGpp在环境胁迫下参与APP适应性调控,并对其毒力有一定的影响。本研究首次证明了(p)ppGpp作为一种信号分子,同样可以调控APP的生长,并且在宿主肺部弱营养环境条件下,APP与致病力相关的表型均受到影响,这为进一步阐明APP的致病机制提供实验依据。

无乳链球菌dnaJ基因缺失株的构建及其致病性研究

为研究dnaJ基因序列与细菌致病力的关系,本研究构建了dnaJ基因缺失株和互补株,并对其致病性进行验证。参照GenBank中无乳链球菌GD201008-001(登录号:NC_018646)目的基因序列分别设计引物,PCR克隆dnaJ基因上、下游同源臂基因序列,通过融合PCR将两个片段连接到一起,构建dnaJ基因上、下游同源臂融合片段,PCR克隆含有启动子序列的dnaJ基因。将dnaJ基因上、下游同源臂融合片段和含有启动子序列的dnaJ基因分别连接链球菌-大肠杆菌穿梭质粒pSET4s和pSET2,电转化GD201008-001感受态细胞,构建dnaJ基因缺失株ΔdnaJ和互补株CΔdnaJ。通过分析ΔdnaJ和CΔdnaJ的遗传稳定性与形态学变化对dnaJ上、下游基因转录的影响,以及生长速率和斑马鱼攻毒试验评价dnaJ基因对无乳链球菌毒力的影响。经PCR鉴定和测序证明,ΔdnaJ和CΔdnaJ构建成功;与野生株GD201008-001相比,ΔdnaJ和CΔdnaJ在细菌染色形态上均无明显差异,但ΔdnaJ在液体培养基中的生长速度明显减缓;dnaJ基因的缺失未对相邻基因的转录造成影响;ΔdnaJ对斑马鱼的毒力明显下降,对斑马鱼的LD 50为5.68×10 4 CFU,约是野生株的241倍。dnaJ基因对无乳链球菌的毒力有显著影响,本试验结果为进一步探究无乳链球菌dnaJ基因的功能提供了参考依据。

布鲁氏菌M5-90ΔvirB2基因缺失株免疫小鼠抗体及相关细胞因子的检测研究

对构建的M5-90ΔvirB2基因缺失株进行免疫原性初步研究。分别用1×106 CFU剂量的M5-90ΔvirB2株与M5-90疫苗株接种BALB/c小鼠,SAT试验和RBPT试验验证体液免疫产生的抗体水平;用ELISA方法检测小鼠外周血细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α。结果表明,抗体水平检测结果显示M5-90ΔvirB2弱于M5-90;细胞因子检测水平显示M5-90ΔvirB2也低于M5-90。本研究为布鲁氏菌疫苗株M5-90的改造奠定了基础,并提供了相关的理论依据。

牛源A型多杀性巴氏杆菌hyaD基因缺失株的构建及其在小鼠上的交叉保护性分析

hyaD为A型多杀性巴氏杆菌荚膜多糖合成相关基因,为探讨该基因对多杀性巴氏杆菌毒力及其免疫保护特性的影响,本研究利用同源重组方法,构建了牛源A型多杀性巴氏杆菌CQ2株(PmCQ2)的hyaD基因缺失株(ΔhyaD)。结果发现,与野生株相比,ΔhyaD的荚膜产生量及其感染后在脏器中的细菌定殖量均显著下降,其毒力显著降低。细胞试验发现,ΔhyaD更易黏附于巨噬细胞,被吞噬数量显著多于野生株,致使巨噬细胞相关炎性因子表达显著上调。hyaD基因的缺失,可调控与荚膜合成、LPS合成转运、铁转运等相关的基因表达显著下调,促使相关保护性抗原基因表达显著上调。以制备的PmCQ2株和ΔhyaD株灭活苗免疫小鼠(加强免疫1次),免疫后第21天分别采用同源和异源多杀性巴氏杆菌攻毒,ΔhyaD株免疫小鼠肺组织感染后24 h无明显或轻微病理损伤,对牛源A型、B型和F型多杀性巴氏杆菌的免疫保护率分别为100%、100%和80%,对兔源、猪源和禽源A型多杀性巴氏杆菌的免疫保护率分别为90%、100%、100%;而野生株PmCQ2除对牛源A型多杀性巴氏杆菌的保护率在80%以上外,对牛源B型和F型及兔、猪、禽源A型多杀性巴氏杆菌均无明显交叉保护作用。研究结果表明,hyaD基因可通过调控荚膜产生及毒力相关因子表达影响菌株毒力;hyaD基因缺失可调控相关交叉保护性抗原表达,赋予菌株交叉免疫保护特性。该研究为多杀性巴氏杆菌通用型疫苗的研发提供了参考。

牛种布鲁氏菌clpP基因缺失株的毒力和免疫保护力评价

为研究布鲁氏菌clpP基因与细菌毒力的关系,采用同源重组的方法,构建牛种布鲁氏菌clpP基因缺失株,用巨噬细胞RAW264.7感染模型和小鼠感染模型评价clpP基因缺失株的毒力,同时测定该缺失株免疫小鼠后产生的免疫保护力。研究发现:牛种布鲁氏菌clpP基因缺失后,在细胞感染模型和小鼠感染模型中的毒力显著降低;clpP基因缺失株感染小鼠后,不引起脾脏肿胀,并且在脾脏内的持续期短于A19疫苗株,说明该基因缺失株具有更高的安全性;使用clpP基因缺失株免疫小鼠后,该基因缺失株无法抵御牛种布鲁氏菌2308株和羊种布鲁氏菌M28株的感染。本研究为揭示布鲁氏菌致病机制和新型布病疫苗研发提供了参考。

单增李斯特菌溶血素S llsB基因缺失株的构建及部分生物学特性研究

为分析单增李斯特菌溶血素S(listeriolysin S,LLS)llsB基因缺失对单增李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)生物学特性的影响,本研究利用同源重组构建了llsB基因缺失株LM90-ΔllsB,并以8周龄、体重40g±5g的健康昆明系雄性小鼠为试验动物对其生长特性、半数致死量(LD50)、脏器载菌量等生物学特性进行了初步研究。结果显示,本研究成功构建了llsB基因缺失株;缺失株在体外连续培养20代过程中能稳定遗传。通过生长曲线测定发现,llsB基因缺失株生长活性略高于亲本株;小鼠感染试验结果显示,亲本株和缺失株的LD50分别为106.17和106.50 CFU;与亲本株相比,缺失株在小鼠肝脏和脾脏中的载菌量均极显著减少(P<0.01),说明缺失株对小鼠的感染能力明显减弱。在小鼠脑中未检出单增李斯特菌。综上所述,llsB基因对LM90的部分生物学特性可能有直接或间接的调控作用,本试验结果为进一步研究LLS的致病机理及防控李斯特菌病提供一定的理论依据。

人Elongator复合物Elp3亚基基因可显著补偿酵母elp3缺失菌株的生长缺陷

从HeLa细胞中分离的人的Elongator复合物在组成及与RNAPⅡ的作用方式上与酵母的E- longator复合物十分相似,但对其功能研究极少。为了研究人的Elongator复合物催化亚基Elp3的功能,将人elp3等基因转入酵母elp3基因缺失的突变菌株(elp3Δ菌株),并对转化菌株进行功能互补实验和ssa3和pho5基因表达分析,结果表明人elp3基因可显著恢复突变菌株对高温和Caffeine的敏感性,在低磷条件下显著补偿了突变株pho5基因表达延迟的缺陷,并可在热激条件下提高ssa3基因的表达。含酵母elp3非HAT区和人elp3 HAT区的融合yhelp3对上述缺陷有着更强的补偿能力。而HAT区催化结构域缺失的yhelp3HAT没有任何补偿能力,表明人Elp3亚基可能与酵母的该亚基功能相似,人Elp3的HAT活性也为其行使功能所必需。

大肠杆菌侵袭基因缺失突变株与人脑微血管内皮细胞的相互作用

ibeA、ibeB、ibeC是与大肠杆菌侵袭人脑微血管内皮细胞(HBMEC)密切相关的基因,但迄今各基因的功能并不清楚。应用侵袭分析和免疫荧光技术分析了各基因的缺失突变型及野生型大肠杆菌对HBMEC的侵袭、细胞骨架与细胞间紧密连接的影响。结果显示:野生型菌大肠杆菌侵袭率为3.46%,而ibeA、ibeB、ibeC缺失突变株分别为0.54%、0.82%和0.73%;ibeA缺失突变型与野生型大肠杆菌作用相似,可引起HBMEC的细胞骨架蛋白分布改变,在细胞膜处呈明显的聚集,而ibeB和ibeC缺失突变株并未引起细胞骨架的明显改变;野生型和ibeA缺失突变型大肠杆菌可引起紧密连接结构的明显改变,而ibeB和ibeC缺失突变株对紧密连接结构的影响不明显。这些观察到的结果提示:ibeB和ibeC基因产物可能在调节细胞骨架和影响细胞紧密连接中起重要作用,而ibeA基因产物在其中的作用较小。

猪种布氏杆菌WboA基因缺失株对绵羊的免疫剂量及免疫程序研究

为优化猪种布氏杆菌WboA基因缺失株(B.suisΔWboA)对绵羊的免疫条件,本研究采用1岁左右的成年雌性绵羊对B.suisΔWboA的免疫剂量及免程序进行了比较研究。实验分5个组进行,其中A、B、C 3个试验组分别以2倍剂量重复接种、4倍剂量重复接种和单剂量1次接种B.suisΔWboA,D组单剂量1次接种猪种布氏杆菌S2疫苗株(B.suis S2),E组为空白对照组。各组羊首免后7 d、21 d和35 d分别采血,测定血清抗体水平;在首免后35 d,分别采用布氏杆菌强毒菌M28株(B.melitensis M28),经腹股沟皮下注射攻毒。攻毒后28 d,分别取试验羊的脾脏分离攻毒菌株。所有试验羊,在实施攻毒前,其精神、食欲均正常。血清抗体测定结果表明,在二免7 d、21 d后,A组和B组试验羊的抗体水平明显高于C组,而且均超过D组试验羊的抗体水平。攻毒后的细菌分离结果表明,攻毒后28 d,A组和B组试验羊的脾脏细菌分离数量明显低于C组试验羊,并且均低于D组试验羊的细菌分离水平。实验结果表明,B.suisΔWboA的免疫剂量由单倍改为2倍或4倍,免疫程序由单剂量1次改为2倍或4倍剂量2次,可以明显提高免疫效果,并达到与亲本疫苗菌株B.suis S2的免疫水平。

单增李斯特菌sRNA00111缺失株构建及对细菌部分生物表型的影响

为了研究sRNA00111对单增李斯特菌的毒力、抗应激能力及生物被膜形成等方面的影响,采用同源重组技术,融合目的基因同源臂构建载体后,在高温和氯霉素条件下连续传代筛选缺失株。分析标准株和缺失株在环境应激反应、毒力及生物被膜方面的影响。结果显示,成功构建基因缺失菌株LM-ΔsRNA00111;与标准株相比,缺失株LM-ΔsRNA00111在不同温度环境下生长曲线无明显差异,表明sRNA00111基因表达不受温度影响;在pH为5.5和9.5的环境下培养,缺失株生长速度均低于标准株,表明该基因在酸性和碱性环境应激中对菌体生长有减缓作用。生物被膜试验表明缺失株形成能力略高于标准株。黏附和侵袭试验可知,缺失株对于Caco-2细胞的侵袭能力明显低于标准株。对靶基因分析,sRNA00111参与并调控了碳代谢和毒力代谢相关的靶基因。综上表明,sRNA00111基因在应激环境条件下,对单增李斯特菌的碳代谢及毒力具有重要的调控作用。

单增李斯特菌溶血素LLS/LLO缺失株的构建及小鼠免疫保护性研究

旨在探究单增李斯特菌溶血素S/O(LLS/LLO)对单增李斯特菌(LM)的部分生物学特性影响及单增李斯特菌溶血素S/O基因缺失株的免疫原性。利用同源重组技术在本实验室已成功构建并保存的LM90SB2Δlls菌株基础上构建LM90SB2Δlls-Δllo,并绘制LM90SB2和LM90SB2Δlls-Δllo的生长曲线,测定半数致死量(LD_(50))、组织载菌量(同时采用灌服和腹腔注射方式)等,进行小鼠免疫保护性研究,分析溶血素基因llsB/hly缺失对LM的生长特性以及毒力的影响。结果:成功构建LM90SB2Δlls-Δllo缺失株,且能在体外稳定遗传。测定生长曲线,LM90SB2的生长活性略高于LM90SB2Δlls-Δllo;LM90SB2的LD_(50)为3.65×10^(7.23)CFU,LM90SB2Δlls-Δllo的LD_(50)大于2.7×10^(9)CFU;通过灌服及腹腔注射,与LM90SB2相比,LM90SB2Δlls-Δllo在小鼠脑、肝、脾中的载菌量均明显减少,差异极显著(P<0.01)。抗体含量除第21天亲本株略高于缺失株,其余天数缺失株均略高于亲本株;通过小鼠免疫保护率结果分析,2株菌免疫后小鼠存活率均为75%,对照组小鼠存活率为30%。本研究表明,llsB/hly基因缺失对LM90SB2的毒力有明显影响,但并不会影响LM的免疫原性,缺失株LM90SB2Δlls-Δllo对亲本株LM90SB2的侵袭具有良好的免疫保护效果。

谷氨酸棒杆菌基因缺失菌株的定点构建

通过目标基因内部缺失片段的获得以及DNA重组交换等技术的有效运用 ,在氨基酸工业重要生产菌谷氨酸棒杆菌中 ,成功地定点构建了两个目标研究基因的单基因缺失菌株和双基因缺失菌株 ,并通过了PCR和测序等方法的分析验证。

流产布鲁氏菌2308株磷酸甘露糖变位酶pmm基因缺失株构建及鉴定

旨在构建流产布鲁氏菌2308株pmm基因缺失株。PCR扩增流产布鲁氏菌2308株pmm基因的上、下游同源臂片段,并与枯草芽孢杆菌上SacB基因片段融合。连接至自杀载体PGEM-7Zf+,构建自杀载体PGEM-7Zf+Δpmm-SacB。电转化至流产布鲁氏菌2308株感受态细胞内,通过氨苄抗性和蔗糖敏感性筛选,获得基因缺失株2308Δpmm,对其进行PCR鉴定和稳定性检测。成功构建可稳定遗传的2308Δpmm基因缺失株,并在15代内未发生回复。在此基础上可以对2308Δpmm进行深入研究。