直接进样-超高效液相色谱-三重四极杆质谱法同时快速测定水中12种微囊藻毒素和1种节球藻毒素

建立了超高效液相色谱-三重四极杆质谱快速检测水中12种微囊藻毒素(MCs)和1种节球藻毒素(NOD)的分析方法。水样经甲醇等体积稀释,聚醚砜(PES)滤膜过滤,滤液直接进样分析,以0.1%(v/v)甲酸乙腈溶液和0.2%(v/v)甲酸水溶液作为流动相进行梯度洗脱,采用ACQUITY UPLC BEH 300 C18柱(100 mm×2.1 mm,1.7μm)进行分离,在电喷雾正离子模式下以MRM方式进行检测,标准溶液外标法定量。方法的检出限为0.03~0.1μg/L,定量限为0.1~0.3μg/L。对自来水和河水样品进行加标回收试验,目标物的平均加标回收率为79.5%~123%,相对标准偏差为1.0%~20%(n=6)。该法简单、灵敏、准确,适用于水中12种微囊藻毒素和1种节球藻毒素的快速测定。

节球藻毒素对斑马鱼胚胎发育的毒性效应

研究了节球藻毒素对斑马鱼(Danio rerio)胚胎的急性毒性效应。采用水浴染毒法,将受精后2h的斑马鱼卵分别暴露于含有0、50、100、200、400、800、1600及3200μg·L-1节球藻毒素的试液中,显微观察不同浓度节球藻毒素对斑马鱼受精卵及其胚胎发育过程的影响,并通过累计孵化率、死亡率、发育畸形率的比较,评价节球藻毒素对斑马鱼胚胎的发育毒性。结果显示:随着节球藻毒素浓度的增加,斑马鱼胚胎的孵化率降低、死亡率和畸形率增加。与对照组比较,浓度≥1600μg·L-1的实验组胚胎发育明显迟缓。浓度≥400μg·L-1时,胚胎孵化率显著降低,72hpf的孵化率由对照组的87%降低到高浓度组(3200μg·L-1)的7%。浓度≥800μg·L-1时,斑马鱼的死亡率、畸形率明显升高;144hpf的死亡率由对照组的7%增加到73%;144hpf的畸形率由对照组的0%增加到93%,畸形主要表现为脊柱弯曲,心包囊肿,尾畸弯曲等。节球藻毒素暴露48hpf对斑马鱼半致死浓度LC50为2572.76μg·L-1,暴露144hpf时为1056.33μg·L-1。节球藻毒素对斑马鱼早期生命发育阶段有一定的抑制效应,高浓度亦会导致死亡。

分散固相萃取-液相色谱-串联质谱法测定淡水鱼中柱孢藻毒素、节球藻毒素和微囊藻毒素

建立了同时检测淡水鱼中柱孢藻毒素、节球藻毒素、微囊藻毒素-RR、微囊藻毒素-YR及微囊藻毒素-LR的分散固相萃取-液相色谱-串联质谱方法。样品粉碎后,用乙腈-水-甲酸(89∶10∶1, v/v/v)提取目标物,C 18 分散固相萃取柱净化,Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18 色谱柱分离,乙腈和水梯度洗脱,在多反应监测(MRM)模式下进行定性分析,基质匹配标准曲线外标法定量。考察了提取溶剂及吸附剂种类对提取效率和净化效果的影响,并优化了液相色谱-串联质谱条件。该法在各自范围内具有良好线性关系,相关系数( R 2)≥ 0.995 4;检出限为5~10μg/kg ,定量限为15~40μg/kg;样品的加标回收率为62.3%~101.2%。该方法前处理方法简单快速,灵敏高效,适用于淡水鱼中柱孢藻毒素、节球藻毒素和微囊藻毒素的有效检测。

反相高效液相色谱法检测鲫鱼组织中的节球藻毒素

通过对鲫鱼各组织前处理条件和反相高效液相色谱条件的优化,建立了反相高效液相色谱法检测鲫鱼肝胰脏、肾脏、血浆及肌肉中节球藻毒素含量的方法。样品利用90%甲醇超声萃取,CNW Bond C18固相萃取柱净化除杂,反相高效液相色谱配置紫外检测器检测。C18柱净化步骤依次为活化-上样-淋洗-洗脱,洗脱剂为含0.1%三氟乙酸（TFA）的90%甲醇水溶液。RP-HPLC检测以0.1%TFA-甲醇（42∶58）为流动相,流速为1.0 m L/min,柱温为30℃,进样量为20μL,检测波长为238 nm。结果表明：在0.05~5.00mg/L浓度范围内,4种鲫鱼组织中节球藻毒素的质量浓度与其峰面积的线性关系良好（r2〉0.99）。在0.08,0.40,2.50 mg/L加标水平下,回收率为79.5%~106.4%,批内相对标准偏差（RSD）为0.54%~5.3%。肌肉中方法检出限为11.30μg/kg,血浆中方法检出限为24.00μg/L。本方法结果准确可靠,可应用于鲫鱼各组织中节球藻毒素含量的动态分布以及残留检测。

节球藻和柱胞藻毒素免疫分析的前处理方法研究

采用固相萃取前处理技术和酶联免疫吸附(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assays,ELISAs)检测技术,研究了水样中节球藻和柱胞藻毒素的免疫前处理方法.由于两种藻毒素极性差异较大,分别对水样中节球藻和柱胞藻毒素采用不同的前处理方法,具体如下.①节球藻毒素:先后用10 mL甲醇和10 mL纯水活化C18柱,以3～4 mL/min的速度上样后用10 mL纯水淋洗,再用12 mL甲醇洗脱节球藻毒素,氮气吹干后纯水定容至1 mL待测.②柱胞藻毒素:先后用10 mL甲醇和10 mL纯水活化碳黑固相萃取柱,以2～3 mL/min的速度上样后用10 mL甲醇淋洗,再用12 mL含0.1%三氟乙酸的甲醇洗脱柱胞藻毒素,氮气吹干后用0.1%氨水定容至1 mL待测.结果表明,这两种前处理方法对节球藻与柱胞藻毒素的ElISAs检测能保证有较好的回收率,加标回收率可分别达到99.4%和77%.

用稀土基涂料实现灰铁件表面层石墨球化工艺的研究

在铸型表面涂刷含有１＃稀土硅铁和７５硅铁的合金涂料，浇注普通灰铸铁成分的铁水，得到了表面层为球状的石墨，过渡层为蠕虫状石墨，本体为片状石墨的复合铸铁材料。表面层石墨球化的厚度可达到２．５ｍｍ以上。

两类藻毒素聚酮合成酶遗传相似性及其二级结构预测分析

研究微囊藻毒素聚酮合成酶、节球藻毒素聚酮合成酶之间的遗传关联性,并对其二级结构进行预测分析.应用聚合酶链反应得到2株蓝绿藻的毒素聚酮合成酶(PKS)基因,并进行基因序列分析.从GenBank中提取产微囊藻毒素、产节球藻毒素藻株的相应基因序列,利用DNAStar和phylip软件分析目的基因一致性及2类藻毒素PKS的进化情况.采用Garnier-Robson法、Karplus-Schulz法预测项圈藻株202A1/35、节球藻株NSOR10PKS蛋白片段的二级结构,Kyte-doolittle法分析蛋白的亲水性,Emini法预测蛋白质的表面可能性.结果表明,2类藻毒素PKS目的基因的相似性非常高;项圈藻属、念珠藻属的微囊藻毒素PKS与节球藻毒素PKS的进化关系较近;2种藻毒素PKS分析片段二级结构具有较大的相似性,其亲水性与表面可能性区域等特征也极为相似.

超高效液相色谱-串联质谱法快速测定地表水中9种藻毒素

采用超高效液相色谱-串联质谱法快速测定地表水中9种藻毒素的含量。地表水样经滤网过滤,离心后,所得上清液以Waters Acquity BEH130色谱柱为分离柱,以不同体积比的0.1%(体积分数,下同)甲酸溶液和含0.1%甲酸的乙腈的混合液为流动相进行梯度洗脱,串联质谱分析中采用电喷雾正离子源和多反应监测模式。9种藻毒素的质量浓度在一定范围内与其对应的峰面积呈线性关系,方法的检出限为0.084～0.175μg·L^(-1)。以空白样品为基体进行加标回收试验,所得回收率为79.4%～113%,测定值的相对标准偏差(n=7)为5.1%～14%。

节球藻毒素研究进展

节球藻毒素(Nodularin)是由泡沫节球藻(Nodularia spumigena)产生的一种环状五肽肝毒素。节球藻毒素对陆生动物和人体均具有毒性和致癌作用,还会影响水生生态系统的结构和功能,对许多陆生植物、水生动物的生长繁殖具有一定的威胁,受到了社会的广泛关注。综述了节球藻毒素的分子结构、检测方法和产生途径,深入讨论了节球藻毒素的环境归趋和毒性效应的研究进展,并对其重要的研究领域提出进一步的展望。

超高效液相色谱-串联质谱法测定藻类保健食品中节球藻毒素

本文建立了超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱法(ultra-performance liquid chromatography-triple quadrupole tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)测定藻类保健食品中节球藻毒素(nodularin, NOD)的方法。样品经甲醇-水(80:20,v/v)混合振荡提取,利用UPLC-MS/MS法进行检测。色谱条件:采用Agilent Infinity Poroshell120 SB-C18色谱柱(2.1 mm×100 mm,2.7μm)分离,以乙腈和水(含0.01%甲酸)为流动相进行梯度洗脱,流速0.3 mL/min,柱温40℃,进样量5μL。质谱条件:采用电喷雾离子源(ESI+),多反应监测模式扫描;外标法定量。结果表明:节球藻毒素在0.5~50μg/L线性范围内线性关系良好,相关系数r=0.9997,检出限为1μg/kg,定量限为3μg/kg。节球藻毒素在低、中、高3个浓度下的平均加标回收率为103.6%~114.8%,相对标准偏差为3.3%~12.5%(n=6)。本方法前处理操作简便,灵敏度高,准确性好,适于藻类保健食品样品中节球藻毒素的快速检测。

超高效液相色谱-串联质谱测定水中10种藻毒素

采用超高效液相色谱-串联质谱法快速测定水中10种藻毒素的含量.水样经过聚四氟乙烯亲水滤膜过滤后,采用BEH C18柱(1.7μm,2.1 mm×100 mm)分离,以超高效液相色谱-电喷雾离子源正离子多反映模式进行检测,外标法定量.10种目标物在0—50μg·L-1浓度范围内线性相关系数在0.99以上,方法检出限为0.08—0.33μg·L-1,在1、10、20μg·L-1的3个水平添加浓度时,其平均回收率在71.32%—114.59%,相对标准偏差为0.77%—9.76%.

基于HT-SELEX筛选的节球藻毒素-R适配体的鉴定

节球藻毒素-R(nodularin-R,NOD-R)是具有强烈肝毒性的蓝藻毒素。然而,现有的NOD-R检测技术均存在一定的局限性,亟待开发一种新的检测方法。本文利用指数富集的配基系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)技术结合高通量测序(HTSELEX),筛选出NOD-R特异的高亲和力适配体。生物膜干涉(biolayer interferometry,BLI)技术对适配体的鉴定结果表明,适配体H62与NOD-R之间的亲和力最高,达到了168 n M。而且,该适配体不与其他毒素结合,具有较高的特异性。以上结果表明,适配体H62有望作为NOD-R检测新方法——适配体生物传感器的分子识别元件。

节球藻毒素诱导草鱼巨噬细胞氧化应激的机理研究

试验以鱼草(Ctenopharyngodon idellus)巨噬细胞为研究目标,进行体外诱导试验,研究节球藻毒素(nodularin,NOD)浓度变化对草鱼巨噬细胞的氧化应激和还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)解毒性能的影响。结果表明NOD会促进草鱼巨噬细胞内自由基产生,导致胞内脂质过氧化,并且在这过程中会抑制超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和过氧化氢酶(catalase,CAT)活性,进一步促进巨噬细胞的氧化应激效应,致使活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)水平和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量相比对照组分别升高2倍和3.8倍。此外,NOD抑制谷胱甘肽-S转移酶(glutathione S-transferase,GST)活性,降低GSH与NOD的结合能力。同时,降低谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPx)活性至对照组56%,提高谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase,GR)活性至对照组3.3倍,促进GSH朝GSSG转变,从而达到降低GSH含量。因此,NOD会作用于鱼巨噬细胞,造成细胞内氧化应激加剧,GSH的解毒能力降低,最终导致巨噬细胞凋亡。

肽类藻毒素液质联用检测研究进展

介绍了微囊藻毒素(MCs)和结球藻毒素(NOD)的结构与毒性。相比于其他方法,在检测肽类藻毒素的应用上,液质联用法(LC-MS)具有操作简单,检测限低,可有效分析组分结构等优点。对检测过程中提取、纯化、分离和检测等重要步骤的适合条件和方法特点以及质谱检测方法前景进行了评述。

超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱法快速测定水产品中微囊藻毒素和节球藻毒素

通过超声提取、固相萃取纯化、超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF-MS)联用技术快速测定水产品中的微囊藻毒素-RR、-YR、-LR和节球藻毒素。分别采用选择离子监测质荷比(m/z)为519.84、1045.66、995.67、825.54分子离子峰进行定量分析。该法检出限为5.0～10.0μg/kg,在浓度0.02～5 mg/kg的范围内,峰面积与样品浓度呈良好线性关系;4种藻毒素的回收率为76.2%～93.7%,相对标准偏差为2.0%～7.1%。采用上述方法对45个太湖水产品样品进行测定,发现有少量水产品中存在藻毒素污染,其中微囊藻毒素-RR最高含量为15.2μg/kg,微囊藻毒素-LR最高含量为0.84μg/kg,MC-YR、节球藻毒素均未检出。此方法可作为监测水产品体内蓄积藻毒素的分析方法。

节球藻毒素的紫外光降解研究

为优化节球藻毒素(NOD)光解处理的最佳光源及反应条件,利用自制光反应装置研究了NOD在暗反应、可见光、暗反应+TiO_2、可见光+TiO_2及单独紫外光(UVA、UVB、UVC)处理下的去除效果,继而选择UVC作为最佳光源进行后续实验,探讨NOD初始浓度、温度、p H和光强对NOD去除效果的影响及反应动力学.结果表明:暗反应、可见光、可见光+TiO_2的组合、UVA和UVB均对NOD无显著去除作用,最高去除率约为20%;UVC处理可以快速去除水中NOD,其去除过程符合二级动力学.UVC处理时,pH对NOD的去除无显著影响;温度升高,NOD去除率缓慢增大,但组间差异并不显著;初始浓度越大,NOD去除率越低;光强增大,NOD去除率快速升高,但到达一定临界值后保持稳定状态.3种因素对UVC去除NOD的影响程度由大到小分别为:光强>时间>温度.光强318μW·cm^(-2)、p H=7、温度30℃、反应时间4 h为最佳处理条件,此时NOD去除率最高,初始浓度为0.1μg·m L^(-1)的NOD几乎被完全去除,残留浓度低于WHO及我国规定的藻毒素含量限值.研究表明,UVC光解NOD安全高效,是一种非常理想的NOD去除方法.

水体中微囊藻毒素和节球藻毒素的UPLC-MS^n分析方法研究

[目的]针对水体中3种代表性的微囊藻毒素(microcystin-RR,MC-RR;microcystin-YR,MC-YR;microcystin-LR,MC-LR)和节球藻毒素(nodularin,NOD),建立一种快速、准确、可靠的痕量分析方法。[方法]样品经C18固相萃取柱净化富集后,采用超高效液相色谱-电喷雾串联三重四级杆质谱法(ultra performance liquid chromatography/tande mmass spectrometry,UPLC-MS/MS),在多反应监测(Multi reaction monitoring,MRM)模式下进行检测,采用基质匹配标准曲线法消除基质效应。[结果]该方法加标回收率为95.7%~115.0%,精密度(RSD)范围为2.43%~6.04%,检测限可达0.05~0.20ng/L。将该方法应用于实际水样分析,水体中3种微囊藻毒素和节球藻毒素含量低于检测限。[结论]建立了水体中3种痕量微囊藻毒素和节球藻毒素的UPLC-MS/MS分析方法,该方法可用于实际水样的检测。

节球藻毒素对小鼠肝脏微结构的影响研究

作为新型生物毒素,节球藻毒素(NOD)常见于爆发水华的水体中,是泡沫节球藻分泌的具有高肝毒性的次生代谢产物.由于其毒性高、暴露途径广且不易降解而日趋受到人们的重视.为了阐明NOD的肝毒性机理,本研究以模式生物小鼠为载体,研究亚慢性NOD诱导下小鼠肝脏在形态学、病理学上的微结构变化.结果表明,10μg·kg-·1d-1NOD下暴露21d可诱导小鼠肝脏出现"草莓状表面"的肉眼可见的形态学改变.在H&E染色下,观察到在NOD暴露21d可诱导小鼠肝脏出现微小结节、细胞嗜酸性病变、炎症细胞浸润、慢性淤胆及脂肪病变等病理学现象.当暴露时间延长到28d时,嗜酸性病变恶化并出现嗜酸小体.在TEM观察下,小鼠肝细胞在NOD的诱导下出现肝细胞核皱缩、染色质凝集或边集、线粒体嵴横纹加深及分布散乱、内质网肿胀、核糖体脱粒等现象,并且在胞质中多有观察到微泡性脂肪变性及吞噬小泡.上述变化充分说明,在亚慢性暴露条件下,NOD依然具有强烈肝毒性.引起NOD慢性肝中毒的主要原因是肝细胞嗜酸性病变及炎症的诱发,并在暴露时间延长后进一步恶化,肝板结构破坏更加严重.

节球藻毒素诱导鲫鱼巨噬细胞凋亡的机理研究

选用杂食性鲤科鲫鱼(Carassius auratus)为材料,采用离体细胞培养诱导方法,研究了节球藻毒素在低剂量暴露条件下对鲫鱼巨噬细胞的毒效应.流式细胞仪结果证实,节球藻毒素可以诱导细胞出现凋亡峰,阻滞细胞G0/G1期和S期,扰乱细胞周期.1、10、100μg·L-1节球藻毒素诱导12 h后,细胞凋亡率分别达到17.37%、27.59%、61.64%,而空白组的仅为3.72%.结果表明,100μg·L-1的节球藻毒素处理12 h后,胞内钙离子浓度比空白组提高了76.9%,而线粒体膜电位则下降了35.8%,氧化应激产物活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)含量则分别为空白组的1.86、2.94倍,Caspase-3和Caspase-9酶活性升高为空白组的2.89、3.73倍,而Caspase-8的酶活性仅比空白组的升高了33.3%,上述细胞凋亡线粒体通路指标均呈现明显的剂量-效应特征.综上所述,节球藻毒素可以诱导鲫鱼巨噬细胞发生凋亡,表现为线粒体依赖型,进而可能影响鱼类免疫系统.