河南豫东地区661例非小细胞肺癌常见驱动基因突变分析

目的分析河南豫东地区非小细胞肺癌(non-small cell lung cancers,NSCLC)患者常见驱动基因的突变情况。方法回顾性分析2022年3月至2023年7月就诊于商丘市第一人民医院的661例NSCLC患者,入组病例均采用了5种基因突变检测试剂盒(荧光PCR法)进行检测。应用统计学方法分析其临床特征与各驱动基因状态之间的关系。结果661例NSCLC中EGFR、KRAS、ALK、ROS1、PIK3CA、BRAF、HER2、RET、MET14和NRAS的突变率分别为47.35%、9.68%、5.45%、1.82%、2.87%、1.82%、1.21%、0.91%、0.61%和0%。EGFR、ROS1和HER2的突变更易发生在在女性患者中(P<0.05),而KRAS突变常发生于男性患者(P<0.05)。EGFR、KRAS和ALK突变在腺癌中的突变率显著高于鳞癌和非小细胞肺癌非特指型(NSCLC.NOS)(P<0.05),PIK3CA在NSCLC.NOS中的突变率最高。KRAS基因在Ⅰ+Ⅱ期的突变率显著高于Ⅲ+Ⅳ期(P<0.05),其他基因与临床分期无明显相关性。与吸烟者相比,非吸烟者的总驱动基因突变率明显较高(P<0.05),EGFR、ALK、PIK3CA、ROS1、BRAF和HER2常发生于非吸烟患者中(P<0.05),而KRAS基因更易发生于吸烟患者中(P<0.05)。沉渣细胞块标本10种驱动基因突变率78.67%,检出率显著高于其他类型标本(P<0.05)。结论EGFR、KRAS、ALK等常见驱动基因与患者性别、病理类型、临床分期以及吸烟具有一定的相关性。质控合格的沉渣细胞块标本用于基因检测的优势明显,可以在有条件的患者中广泛推广;ARMS-PCR法联合检测10种基因可作为初诊初治NSCLC患者的首选基因检测方法。

华南热带水库拟柱孢藻产毒基因型的低优势及影响因子分析——以珠海市水库为例

研究以珠海市20座水库两次(2018年和2022年)调查数据为基础,分析华南热带地区产毒拟柱孢藻的发生规律和拟柱孢藻毒素(CYN)的健康风险。基于rpoC1和cyrJ基因的荧光定量PCR分析发现,在两次采样的40个样品中均检到拟柱孢藻,在其中的33个样品中检到产毒拟柱孢藻。种群内产毒基因型的比例在0.046%—38.66%,表明产毒株广泛存在但不占优势。与2018年相比,20座水库的总拟柱孢藻丰度均值在2022年增加近10倍,但两年的产毒拟柱孢藻丰度无显著差异;产毒基因型的比例明显下降,比例均值和最大值分别从2018年的14.86%和38.66%降至2022年的4.17%和17.24%;CYN浓度与产毒细胞比例具有类似的变化趋势,平均浓度也从0.56降至0.19μg/L。线性混合效应模型分析表明,非产毒基因型丰度随无机磷的升高及硝氮的下降而显著增加,而产毒拟柱孢藻比例随水温升高而增加。

一种基于线粒体分离纯化技术的新型线粒体DNA深度测序方法

目的 开发并评估一种基于线粒体分离纯化技术的线粒体DNA(mtDNA)深度测序方法。方法 探索从细胞中分离mtDNA的最适条件;基于该方法对外周血单个核细胞(PBMC)样本进行mtDNA深度测序,通过测序片段(reads)中mtDNA reads占比评估测序文库中mtDNA的纯度,通过Sanger测序验证该方法所检出的mtDNA变异的准确性。结果 采用含低浓度NP40和不含Tween-20的裂解液裂解细胞获得的mtDNA纯度高,几乎不含细胞核基因组。在6例PBMC样本中应用该方法检测结果显示,mtDNA reads占比为87.8%~92.8%,且检测出多个mtDNA变异。对其中1个异质性变异和3个同质性变异进行Sanger测序验证,二者结果相一致。结论 本研究开发的基于线粒体分离纯化技术的mtDNA深度测序方法可应用于PBMC样本,能准确且灵敏地检出线粒体基因组的同质性和异质性变异。

乳腺癌新辅助化疗后病理未完全缓解患者预后及复发转移的危险因素分析

目的探讨乳腺癌新辅助化疗后病理未完全缓解(non⁃pathologic complete response,non⁃pCR)患者的预后及复发转移的危险因素。方法回顾性分析2016年1月至2020年12月期间在广西医科大学附属肿瘤医院乳腺外科及2020年1月至2022年12月在海南医学院第一附属医院乳腺外科诊断乳腺癌并接受新辅助化疗的500例患者的临床特征。比较病理完全缓解(pathologic complete response,pCR)及non⁃pCR患者的无病生存期(disease⁃free survival,DFS)和总生存期(overall survival,OS),通过Cox比例风险模型筛选出新辅助化疗后non⁃pCR患者复发转移的独立危险因素。结果本研究的中位随访时间为38个月(范围:6~81个月),中位DFS及OS均未到达。新辅助化疗后的pCR率为19.4%(97/500)。pCR和non⁃pCR患者5年DFS率分别为91.9%和81.2%(P=0.003),5年OS率分别为96.1%和81.6%(P=0.007)。新辅助化疗后共有71例患者出现复发转移,其中pCR患者复发转移4例,non⁃pCR患者复发转移67例。Cox回归分析结果显示,年龄>35岁(HR=0.393,95%CI:0.220~0.701)是non⁃pCR患者术后复发转移的保护因素,而组织学分级3级(HR=3.568,95%CI:2.050~6.210)、高Ki⁃67指数(HR=2.742,95%CI:1.528~4.921)、术后Ki⁃67指数的升高(HR=5.349,95%CI:2.470~11.586)及高pN分期(HR=6.716,95%CI:2.922~15.436)是non⁃pCR患者术后出现复发转移的独立危险因素。结论新辅助化疗后获得pCR可改善乳腺癌患者的DFS和OS;年龄≤35岁、组织学分级3级、Ki⁃67指数>30%、术后Ki⁃67指数升高及pN高分期是non⁃pCR患者术后复发转移的独立危险因素。

非小细胞肺癌中RASSF6与MST1的表达及病理意义

目的检测RAS相关结构域家族成员6基因(RASSF6)及MST1在非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达情况,并探讨二者对NSCLC患者的病理意义。方法利用GEPIA2数据库测定肺腺癌(LUAD)和肺鳞癌(LUSC)中RASSF6和MST1基因表达水平;通过qRT-PCR实验测定NSCLC新鲜组织中RASSF6、MST1 mRNA表达水平;免疫组化法检测石蜡标本中RASSF6、MST1蛋白表达。Spearman探讨二者的相互关系。结果与癌旁正常肺组织比较,NSCLC的RASSF6 mRNA和蛋白表达水平均明显增加(P<0.05),但MST1 mRNA和蛋白表达水平均明显降低(P<0.05)。RASSF6及MST1蛋白表达均与临床分期、淋巴结转移相关(P<0.05),而与NSCLC患者的年龄、性别、组织分型及分化程度无关(P>0.05);且RASSF6与MST1呈负相关(r_(s)=-0.227,P<0.05)。结论RASSF6和MST1可能与NSCLC的进展有关,有望成为NSCLC患者新的潜在治疗靶点。

胸腔积液不同类型标本用于非小细胞肺癌驱动基因检测的临床价值研究

目的分析非小细胞肺癌(NSCLC)患者胸腔积液上清、细胞沉淀、细胞蜡块用于驱动基因检测的准确性。方法回顾性纳入2021-01—2022-03首都医科大学附属北京胸科医院确诊并发胸腔积液且具有同期配对组织基因检测结果的NSCLC患者45例,采用蝎形探针扩增阻滞突变系统荧光定量PCR(ARMS-PCR)对患者胸腔积液上清、细胞沉淀和细胞蜡块进行肺癌靶基因变异检测。结果胸腔积液三种类型标本中共检出EGFR、KRAS、BRAF、MET、HER2、PIK3CA、ALK共7个基因变异。以组织基因检测结果为参考,胸腔积液上清总体变异检测敏感度为80.0%(24/30),特异度为93.3%(14/15),高于细胞沉淀和细胞蜡块。在DNA层面,胸腔积液上清核苷酸变异敏感度最高,为84.6%(22/26);对于RNA融合变异,上清与细胞蜡块敏感度一致,均为50.0%(2/4),高于细胞沉淀的25.0%(1/4)。胸腔积液细胞学结果对上清、细胞沉淀和细胞蜡块驱动基因总体变异、核苷酸变异检出有影响,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论晚期并发胸腔积液NSCLC患者在无法获取组织标本情况下,胸腔积液,尤其是上清标本是进行靶基因检测,有效指导临床治疗决策潜在优质标本类型。

宫颈癌患者血清lncRNA XIST的表达及其意义

目的探讨血清长链非编码RNA(lncRNA)XIST在宫颈癌辅助诊断中应用的可能性。方法选取2018年12月至2019年12月南通大学附属肿瘤医院的92例初诊宫颈癌患者,60例宫颈上皮内瘤变(CIN)患者,38例子宫良性病变(子宫肌瘤、宫颈炎症)患者及54例体检健康者作为研究对象。分别用化学发光法和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测各组标本血清糖类抗原125(CA125)、人鳞状细胞癌相关抗原(SCCAg)水平和血清lncRNA XIST相对表达水平并进行方法学评价。分析血清lncRNA XIST相对表达水平与临床病理参数间的关系,并用受试者工作特征曲线评价血清lncRNA XIST、CA125、SCCAg单独与联合检测的诊断效能。结果宫颈癌组、CIN组、良性病变组血清lncRNA XIST相对表达水平高于对照组(P<0.01);宫颈癌组血清lncRNA XIST相对表达水平高于CIN组及良性病变组(P<0.01);CIN组与良性病变组血清lncRNA XIST相对表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。不同年龄、绝经状态、肿瘤FIGO分期、淋巴结转移宫颈癌患者血清lncRNA XIST相对表达水平比较差异有统计学意义(P<0.05),不同肿瘤最大径宫颈癌患者血清lncRNA XIST相对表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。lncRNA XIST鉴别宫颈癌患者与健康者的曲线下面积大于CA125、SCCAg单项检测,且其灵敏度达90.21%,优于SCCAg、CA125单项检测,两两联合和三者联合时灵敏度均得到提高,三者联合时最高达98.91%。宫颈癌患者血清lncRNA XIST相对表达水平与CA125、SCCAg水平均无相关性(P>0.05)。结论血清lncRNA XIST可以作为一种新的生物学标志物,用于宫颈癌的早期筛查;其相对表达水平可作为宫颈癌与CIN及子宫良性病变的辅助鉴别指标。

尿液细胞mRNA联合生物标志物对IgA肾病肾纤维化诊断价值研究

目的:筛选诊断IgA肾病肾纤维化的新型无创生物标志物。方法:建立IgA肾病靶向实时荧光聚合酶链式扩增反应芯片,检测74例IgA肾病患者和31例健康对照的尿液mRNA,筛选差异表达基因建立联合生物标志物预测肾纤维化模型。结果:50种尿液mRNA在IgA肾病组和对照组之间差异表达(P<0.05)。5种mRNA与血肌酐和肾小球滤过率相关(P<0.05)。BCL-2、PAI1、TGF-β1和VIM mRNA水平与肾纤维化的严重程度相关,并且能区分中-重度纤维化和无-轻度纤维化(P<0.05)。使用Fisher线性判别建立BCL-2、PAI1、TGF-β1、VIM联合生物标志物预测模型,其敏感性91.3%,特异性85.7%,ROC曲线下面积0.92,约登指数0.77(P<0.05)。结论:4种尿液mRNA组成的无创生物标志物具备诊断IgA肾病肾纤维化的潜力。

对虾一种无包涵体杆状病毒病原的PCR检测

为建立对虾无包涵体杆状病毒的快速诊断技术，应用PCR技术分别对暴发性流行病发生前、流行中和发病后的对虾样品进行了检测．根据已克隆的对虾杆状病毒部分基因组序列而设计的引物能特异性地扩增出靶DNA片段，最低可以检测1pg的病素DNA．由典型发病症状对虾的胃、腮、肝胰腺、中肠、游泳足、肌内和心脏等器官和组织中成功地检测到病毒．不同组织和器官经扩增得到的信号强弱不同：病虾的胃扩增得到的信号最强，中肠、肌肉、心脏和游泳足次之，腮和肝胰腺信号最弱，说明病毒在不同组织和器官中数量及感染程度不同．在对虾发病前及发病后，用二次PCR还能检测表面不发病呈隐性感染状态的对虾携带的病毒；而对野生健康虾的检测结果为阴性．研究表明，PCR是检测对虾暴发性流行病快速、灵敏而准确的方法，对病毒病的早期诊断、防治和高健康对虾品种的选育具有指导意义．

非小细胞肺癌MDR1-mRNA、MRP-mRNA及LRP-mRNA表达的研究

目的 观察肺癌组织及癌旁肺组织MDR1 mRNA、MRP mRNA及LRP mRNA的表达。方法 采用RT PCR法检测 30例肺癌患者癌组织和正常肺组织中MDR1 mRNA、MRP mRNA和LRP mRNA的表达情况。结果 MDR1 mRNA在肺癌组织及癌旁肺组织的表达阳性率分别为 40 %及 16 .6 7% (P =0 .0 45 ) ,其表达与细胞分化程度、临床分期及病理类型无明显关系。MRP mRNA在肺癌组织及癌旁肺组织的表达分别为 43 .33 %及 2 6 .6 7% ,低分化者MRP的表达率明显高于中高分化者 (P =0 .0 3) ,其表达与临床分期无明显关系。LRP mRNA在肺癌组织及癌旁肺组织的表达分别为 5 6 .6 7%及 10 % (P =0 .0 0 0 4) ,其表达与肿瘤类型、临床分期及癌细胞的分化程度无明显关系。 30例肺癌组织中MDR1 mRNA、MRP mRNA、LRP mRNA共同表达者 7例(2 3 .33 % ) ,三者均无表达者 10例 (33 .33 % ) ,三者的一致性达 5 6 .6 7%。结论 MDR1 mRNA、MRP mRNA、LRP mRNA在肺癌的耐药中可能起重要作用。

微卫星DNA非变性PAGE银染法的分析探讨

微卫星DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),是一种常用的DNA检测手段,具有很好的分离微小差异DNA片段的能力,而银染法使该方法得到了广大科研工作者的青睐,但是,在染色过程中,常可能出现一些问题,令结果的判断难以达到满意的效果。为此,对该方法进行了一系列的分析和探讨。

长春市儿童医院1998～2001年婴幼儿杯状病毒腹泻流行病学研究

人类杯状病毒(humancalicivirus,HuCV)是引起儿童和成人非菌性胃肠炎的主要病原之一。为了掌握HuCV在我国的流行情况,1998年7月至2001年6月,从长春市儿童医院2343例5岁以下腹泻患儿中共收集粪便标本1264份,其中1056份来自2135例住院患儿。对轮状病毒检测为阴性的588份标本,经多价酶免疫试验(EIA)和两组引物反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测HuCV,202份为阳性,其中住院患儿标本178份,HuCV检出率为16 9%。HuCV腹泻以2岁以下儿童为主(占96%),流行高峰季节为11月至次年3月。选择17株HuCV进行分子鉴定,15株属GⅡ 4群,1株属GⅡ 3群,另1株属GⅠ 2群,表明GⅡ 4群HuCV是我国流行的优势株。根据HuCV住院患儿的监测资料初步估计,HuCV腹泻住院率约为0 5‰～2 4‰。讨论了长春地区HuCV的流行趋势和疾病负担。以上结果为我国HuCV腹泻的预防和控制提供了科学依据。

miR-19a和miR-19b在非小细胞肺癌中的表达

目的通过检测非小细胞肺癌患者癌组织和血清中miR-19a、miR-19b的表达水平,探讨其与临床病理参数的关系和作为肿瘤分子标志物的可能性。方法采用实时荧光定量PCR技术检测正常人和非小细胞肺癌患者血清,以及非小细胞肺癌组织和癌旁组织中miR-19a、miR-19b的表达,分析miR-19a、miR-19b的表达与非小细胞肺癌临床病理参数的关系。采用ROC曲线分析miR-19a、miR-19b对非小细胞肺癌的诊断价值。结果 miR-19a、miR-19b在癌组织中的表达量明显高于癌旁正常组织(P<0.05);miR-19a、miR-19b在NSCLC血清中的浓度显著高于对照组。miR-19a的ROC曲线下面积0.989,灵敏度95.1,特异度94.0;miR-19b的ROC曲线下面积0.983,灵敏度93.4,特异度94.0。结论非小细胞肺癌患者癌组织和血清miR-19a、miR-19b高表达,miR-19a、miR-19b有望作为NSCLC诊断及预后评价的检测指标。

应用多重PCR方法快速鉴定结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌

目的探讨应用多重PCR技术快速鉴定结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的可靠性。方法根据结核分枝杆菌种的MTP40基因序列(396bp),分枝杆菌属的32kD基因序列(506bp),结核分枝杆菌复合体群的IS6110序列(984bp),采用3对特异性引物(PT1,PT2;MT1,MT2;IS5,IS6)在同一反应体系和条件下对92株结核杆菌临床分离株和5株非结核分枝杆菌临床分离株进行扩增,并与标准菌株进行比较。结果92株结核分枝杆菌临床分离株中,90株扩增出与结核分枝杆菌H37RV标准株相同的396bp、506bp、984bp3条DNA片段,敏感性达97.8%,特异性为100%;5株非结核分枝杆菌临床分离株均扩增出506bpDNA片段,敏感性达100%,特异性为100%。结论应用多重PCR方法,对结核分枝杆菌及非结核分枝杆菌进行鉴定,结果快速、准确、可靠,为临床结核病与非结核分枝杆菌病的快速诊断提供了有效的手段,具有很好的临床应用价值。

实时荧光定量PCR方法检测非霍奇金淋巴瘤患者B淋巴细胞刺激因子表达水平

目的:建立实时荧光定量PCR方法(RFQ-PCR)检测非霍奇金淋巴瘤(NHL)患者B淋巴细胞刺激因子(BAFF)表达水平。方法:47例NHL患者及20例健康对照,采用实时荧光定量PCR方法检测其外周血单个核细胞中的B淋巴细胞刺激因子表达水平。结果:RFQ-PCR检测BAFF含量的示灵敏度为10 pg/ml,低浓度样本批内和批间变异系数(CV)分别为8.56%和11.32%,高浓度样本批内和批间CV分别为0.76%和4.58%。NHL患者和健康对照者BAFF mRNA表达量分别为(0.48±0.023,0.25±0.023),两者具有显著性差异(P=0.0001)。结论:RFQ-PCR检测BAFF mRNA含量的方法,具有较好的检测灵敏度和重复性。NHL患者BAFF mRNA高表达,提示BAFF可能在NHL发生发展中发挥重要作用。

用聚合酶链反应和酶联免疫吸附试验检测无包埋体对虾病毒

聚合酶链反应（ＰＣＲ）检测证明，某虾场发病的中国对虾（Ｐｅｎａｅｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）感染无包埋体对虾病毒（ＮＯＳＶ），或称中国对虾类杆状病毒（ＰｃＢＬＶ）；野生脊尾白虾（Ｅｓｏｐａｌａｅｍｏｎｃａｒａｉｎｉｃａｕｄａ）也感染ＮＯＳＶ，并可能经卵垂直传播；南美白对虾（（Ｐｅｎａｅｕｓｖａｎｎａｍｅｉ）亦可感染该病毒而发病。经ＰＣＲ扩增纯化的皮下及造血组织坏死症杆状病毒（ＨＨＮＢＶ）与ＮＯＳＶ的核酸结果表明，两者为同一种病毒。选取经ＰＣＲ检测的９份样品，重新编号后用ＥＬＩＳＡ法进行检测，两种方法判定的结果完全相同。将ＰＣＲ和ＥＬＩＳＡ双阳性的样品制备超薄切片，观察到ＮＯＳＶ感染的典型细胞病变。可以认为，在国内流行的中国对虾“暴发病”病原为ＮＯＳＶ。

胃癌长链非编码RNA SNHG16异常表达及其临床病理意义

目的:检测长链非编码RNA SNHG16在胃癌组织与癌旁组织中的表达及其临床意义。方法:实时荧光定量PCR(quantitative real time-PCR,qRT-PCR)法检测SNHG16在41例胃癌组织及5株不同分化程度细胞系和胃黏膜上皮细胞中的表达情况,分析SNHG16表达与胃癌临床病理的相关性。结果:胃癌组织中SNHG16相对于癌旁组织其表达量为(2.64±1.59),表达显著上调且与胃癌侵袭相关(P<0.05,r=0.361)。与GES-1细胞株比较,HGC-27中SNHG16相对表达量为(4.21±0.69),MGC-803为(1.99±0.21),BGC-803为(1.90±0.44),SGC-7901为(0.76±0.05),AGS为(3.36±0.81);SNHG16在SGC-7901中低表达,但差异无统计学意义(P>0.05),在其他4株细胞中显著高表达(P<0.01)。结论:SNHG16在胃癌组织中高表达,且其表达水平与胃癌侵袭程度相关,可成为胃癌预后监测及治疗的靶点。

高粱非编码区SSR引物设计以及e-PCR的验证

本研究通过在NCBI公共数据库的高粱全基因序列中进行简单重复序列SSR搜索,结果显示共有87950个SSR位点,共有1134种重复,其中二元碱基和三元碱基重复所占比例最大,分别占43.36%,32.38%。根据SSR搜索结果设计了高粱SSR引物,通过两次e-PCR验证和筛选引物,随机合成了50对引物。以先锋和乐食两个高丹草品种为材料进行引物的筛选和评价。结果表明,50对引物中有46对引物出带,但只有8对引物具有多态性。这说明在高粱非编码区设计的引物多态性并不高于EST-SSR引物,但对高粱的SSR引物的开发可以起到补充和促进作用。

肺癌患者外周血CK19mRNA与微转移的实验研究

目的:检测非小细胞肺癌(NSCLC)患者外周血CK19mRNA的表达情况,探讨其诊断NSCLC外周血微转移的临床意义。方法:选取初治NSCLC患者40例及健康志愿者50例,用实时荧光定量RT-PCR方法检测外周血CK19mRNA,相对定量分析结果。结果:肺癌组与健康对照组CK19mRNA阳性表达率分别为72.5%(29/40)、14.0%(7/50),差异显著(P<0.05);相对表达量分别为1.69±0.44、0.28±0.12,有显著差异(P<0.05)。阳性表达率与原发肿瘤部位、原发肿瘤大小、临床分期、分化程度及病理类型无相关性;相对表达量在中央型、T3+T4、Ⅲ期+Ⅳ期及低分化患者数值较高,但不具有统计学意义,鳞癌患者高于腺癌,且有显著差异(P<0.05)。结论:CK19mRNA作为Real-timeRT-PCR法检测NSCLC外周血微转移的分子标记物,具有一定临床应用价值,但特异性仍需提高,应进一步扩大样本进行研究及随访。相对定量分析是一种值得推荐、准确简便的荧光实时相对定量方法。

miR-145在非小细胞肺癌中的表达

目的:检测非小细胞肺癌患者癌血清和组织中miR-145的表达量与临床病理参数的关系,探讨其作为非小细胞肺癌分子标志物的可能性。方法:采用实时荧光定量PCR检测非小细胞肺癌及健康血清,以及非小细胞肺癌组织和对应癌旁组织中miR-145的表达量,分析miR-145的表达与非小细胞肺癌临床病理参数的关系。采用ROC曲线分析miR-145对非小细胞肺癌的诊断价值。结果:miR-145在癌组织中的表达量明显低于癌旁组织(P<0.05);miR-145在患者血清中的表达显著低于对照组(P<0.05)。miR-145的ROC曲线下面积(AUC)为0.875,灵敏度为88.5%,特异度为84.8%。结论:非小细胞肺癌患者癌组织和血清miR-145低表达,miR-145有望作为NSCLC早期的诊断指标。