不结球白菜(Brassi cacampestris ssp.chinensis Makino)种质资源SRAP遗传分化分析

利用SRAP分子标记分析了国内外64份不结球白菜种质资源的DNA遗传多样性和遗传分化。21对引物组合共检测出215个位点,其中112个为多态性位点,多态性比率达52.09%,平均每对引物组合产生10.24个位点和5.33个多态性位点。不结球白菜各类型中普通白菜的Nei’s基因多样性指数(0.1410)和遗传丰富度[(190)88.37%]最高;各生态区域中江淮流域不结球白菜的Nei’s基因多样性指数(0.1451)和遗传丰富度[(185)86.05%]最高;国内的Nei’s基因多样性指数(0.1293)和遗传丰富度[(188)87.44%]分别高于国外。遗传变异估算表明,不结球白菜遗传分化系数58.22%,大部分变异存在于种群间;基因流为0.4031,说明群体间基因流动较少,遗传分化程度较高。以遗传相似系数0.872为截值,可把不结球球白菜分为Ⅵ个类群。

白菜和芜菁Ogura型雄性不育系与保持系的获得及其细胞学观察

通过甘蓝型油菜Ogura细胞质雄性不育材料与白菜、芜菁的种间杂交和连续回交,获得了不育性稳定的白菜、芜菁Ogura细胞质雄性不育系‘新选Ogu28-4’、‘矮脚黄Ogu33-14’和‘耐病Ogu18-4’及其相应的保持系。细胞形态学研究表明:虽然这3个不育系核背景不同,但花药败育时期基本相同,均具有单核败育型的特征;小孢子到单核期后不再向前继续发育,而是迅速退化以至解体,开花前彻底败育;不育系的花药在减数分裂早期绒毡层细胞中已出现液泡,有肥大趋势,而正常花药绒毡层的发育在减数分裂过程中达到高峰,四分体时出现退化迹象,开花前完全解体。不同的眙Ogura细胞质雄性不育系,虽然核背景不同,但花药败育的时期基本相同,说明Ogura CMS胞质互作关系稳定,受核背景影响小。

提高白菜离体培养植株再生频率的研究

选用 7个白菜类蔬菜栽培品种和 1个杂交亲本进行离体培养植株再生试验 ,筛选出最佳培养基配方为 1/2倍NH+4 浓度的MS培养基附加BAP 2mg/L、NAA 0 .4 5mg/L和AgNO37.5mg/L ,大幅度提高了植株的再生频率 ,高达 84 .8% ,大大缩短成苗周期 ;子叶—子叶柄接种后 ,最早的仅需 6d即可分化出不定芽 ,从接种到再生苗的移栽最快的仅需 4 0d ,平均一批约需 50d ,达到了高频快速的要求 ;该培养基对白菜类蔬菜的不同品种有着较广的适应性。对不定芽的发生过程进行组织学观察表明 ,在本试验条件下 ,白菜离体培养植株再生方式为外植体直接出芽。再生苗生根后移栽的成活率可达 95%以上。

白菜OguCMS相关MYB家族新基因BcMYBogu的克隆与特征分析

为研究CMS核质互作的分子机理,将甘蓝型油菜(Brassica napus L.)和白菜(B.campestris L.ssp.chinensis Makino)杂交并连续回交6代获得白菜OguCMS,在与保持系花药细胞学比较的基础上,运用cDNA-AFLP筛选得到白菜OguCMS早、中期花蕾提早表达的MYB-like差异片段,利用RACE克隆得到该片段的cDNA全长,命名为BcMYBogu(GenBank登录号:EF127861),对其氨基酸序列和表达特征进行研究。结果表明,白菜OguCMS绒毡层在四分体后增生,高度液泡化,导致小孢子花粉外壁异常,细胞质同外壁分离并降解;花药变白;BcMYBogu具有典型的MYBDNA结合域—W残基和SH[AL]QKY[RF]基序;系统进化分析显示BcMYBogu与AtMYB26,AtMYB32和AtMYB4等聚类在同一分枝;RT-PCR分析表明BcMYBogu在莲座叶、花茎和花蕾中均有表达,但在OguCMS花蕾中表达量显著上升。由此推测BcMYBogu是一个新的与白菜OguCMS相关的MYB家族新成员。

白菜核雄性不育两用系花蕾的mRNA差别显示及其cDNA差异片段分析

用 m RNA差别显示技术对白菜核雄性不育两用系中不育株群与可育株群花蕾总 RNA进行了比较分析 .在 6种反转录模板和 2 0种差异随机引物共 12 0种组合的选择扩增中共回收了 18个 c DNA差异片段 ,对其中 6个 c DNA差异片段进行 Northern验证 ,获得了一个白菜核雄性不育两用系可育株群并在花蕾中特异表达的阳性差异片段 ,简称为 B0 30 2 - 4 .Northern验证结果表明它在不育株中的表达受到了明显的抑制 ,其长度为 4 6 3bp.经 Gen Bank BLAST查询 ,它与拟南芥第一条染色体上编码细胞色素 P4 5 0的基因 CYP86 C4核苷酸序列有 84 .3%的同源性 .

白菜雄性不育相关新基因BcMF1的分离及特征分析

【目的】筛选与白菜雄性不育性状相关的新基因,为研究植物雄性不育的分子机制提供依据。【方法】利用cDNA-AFLP技术分析白菜核雄性不育两用系‘ZUBajh97-01AB’的表达差异,在可育株群中扩增出1条特异条带BcMF-A15T17,通过RACE和PCR技术扩增得到该基因的cDNA和DNA全长序列,并用Northern杂交验证了该基因的表达特征。【结果】该基因被命名为BcMF1,它的cDNA全长为1684bp,基因全长为1985bp,BcMF1基因仅在两用系可育株群的中、大花蕾中特异表达。推测的BcMF1蛋白含有471个氨基酸,与拟南芥未知功能蛋白家族DUF1216成员的相似性较高,预测该蛋白是一个定位在胞外的分泌蛋白。【结论】BcMF1基因是一个与白菜细胞核雄性不育相关的新基因。

白菜核雄性不育两用系AFLP扩增特异片段的克隆及序列分析

利用AFLP技术从白菜核不育两用系"矮脚黄"可育系DNA中得到一个特异扩增片段MF-14.Southern杂交结果证实不育系也存在该片段的同源序列;回收该特异扩增片段并将其克隆到pGEM-TEasy载体进行序列测定.测序结果表明,该片段全长289bp,其碱基组成为A+T=46.02%.与白菜RAPD特异片段S107及其他育性相关基因核苷酸序列比较,同源性均低于50%.表明该片段为一新的序列.

不同倍性不结球白菜Pol CMS及保持系生理生化特性比较

对二、四倍体不结球白菜Pol CMS及其保持系花蕾和薹叶进行生理生化特性比较分析,结果表明:不育系花蕾中可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸含量均显著低于保持系,且各指标在不育系中四倍体低于二倍体,而在保持系中则四倍体高于二倍体;不育系MDA含量,POD、SOD、CAT活性均高于保持系,不育系中四倍体均高于二倍体,而保持系中四倍体均低于二倍体;薹叶中MDA含量,POD、SOD、CAT活性均为不育系高于保持系,不育系中四倍体高于二倍体;POD、EST同工酶显示不育系与保持系间均具特异酶带,但不同倍性间并无差异。

白菜雄性不育相关基因BcMF4基因功能的RNAi验证

BcMF4(Brassica campestris Male Fertility 4)是前一阶段从普通白菜(Brassica campestris ssp．chinensis var．communis,syn．B．rapa ssp．chinensis var．communis)核雄性不育两用系的可育株中分离到的雄性不育相关基因。本研究根据BcMF4基因的cDNA序列设计两对特异引物,从普通白菜花蕾cDNA中扩增出两个片断后连接至双元载体pBI121中,得到了RNAi(RNA interference)植物表达栽体pBI-B4R,并导入了农杆菌LBA4404菌株中;通过组织培养途径转化菜心(B．campestris ssp．chinensis var,parachinensis),72．2％的菜心转基因植株中45．8％的花粉为缩小而空瘪的畸形,而且这些植株的花粉离体萌发率降低至23．7％;Northern杂交显示,转基因植株的花粉畸形,是由于BcMF4基因片段的插入使BcMF4基因的表达受到了抑制。结果表明,采用RNAi技术下调了BcMF4基因的表达,导致了菜心转基因植株部分花粉的不育,证明BcMF4基因在普通白菜和菜心等白菜植物的花粉发育中起着重要作用。

不结球白菜同源四倍体Pol CMS及其保持系花药发育的解剖学研究

以秋水仙素人工诱变获得的不结球白菜同源四倍体Pol CMS及其保持系为材料，采用石蜡切片法研究其花药发育过程。结果显示：四倍体Pol CMS与保持系花药发育差异明显，不育系花药发育受阻于孢原细胞分化期，不形成药室，属无花粉囊型。极少数温敏型花药能产生1～2个花粉囊，但四分体时期绒毡层提早退化，导致成熟小孢子数目减少。四倍体保持系花药发育过程与二倍体基本一致，同一时期的可育小孢子四倍体比二倍体大，二倍体花粉粒都为3个萌发孔，而四倍体多为4个萌发孔。四倍体保持系同一花粉囊中花粉粒发育有不同步现象，花粉粒败育频率比二倍体高。研究表明，不结球白菜同源四倍体Pol CMS比其二倍体Pol CMS不育更彻底，更具廊用性。

白菜离体春化相关基因表达的cDNA-AFLP分析

借助cDNA-AFLP技术分离到15个与白菜离体春化反应相关的表达序列标签(EST)。Blast结果表明:低温春化处理抑制性表达的12个EST,多与异化作用相关基因同源性较高;春化诱导表达的3个EST,分别与编码核糖体蛋白的亚基(或与自主开花途径相关的FAC基因连锁的因子),ATPase的亚基,小G-蛋白亚基的基因同源性较高。

不结球白菜硝酸还原酶基因cDNA的克隆及序列分析

采用离体法测定了经50 mmol.L-1的KNO3诱导不同时间后的雪克青、苏州青、矮脚黄、乌塌菜(黄心乌)4个不结球白菜品种叶片硝酸还原酶的活性。结果表明,4个品种的硝酸还原酶活性变化趋势相似,且分别在4、4、6、6 h达到最高峰。苏州青经50 mmol.L-1的KNO3诱导4 h后,提取其叶片总RNA,用RT-PCR方法获得硝酸还原酶基因cDNA的2条片段,长度为1 125 bp和438 bp,分别编码374个和135个氨基酸,命名为nr1125和nr438。nr1125在GenBank的登录号为DQ001901。

菜心BrcuFCA基因的克隆与表达分析

本文以菜心(Brassica campestris L.ssp.chinensis(L.)Makino var.utilis)为实验材料,比较了Trizol法、改进Trizol法及改良SDS法提取菜心总RNA的效果。结果表明改进Trizol法集中了操作简单、耗时短、所需试剂种类少,且完整性好,产量和纯度均高等多重优点,成为提取菜心总RNA首选方案。同时文章以甘蓝型油菜及其它物种的FCA保守区设计引物,将质量高的菜心总RNA反转录合成cDNA,通过RT-PCR从菜心的早、晚熟品种中均克隆得到与开花有关的基因片段,将之命名为BrcuFCA,片段长1001bp,GenBank登录号为EU700363,与甘蓝型油菜及拟南芥FCA氨基酸同源性分别达到了98%和82%。另一方面,本研究还利用半定量RT-PCR研究了BrcuFCA不同时空表达特性,并结合已发表的开花调控遗传途径中两个关键基因BrcuFLC和BrcuFRI时空表达特性研究结果,推测菜心主要的抽薹开花途径不是春化和FRI-依赖途径,而很可能是自主开花途径。本研究为菜心抽薹开花分子机理的研究提供理论依据。

不结球白菜热激蛋白基因克隆及表达

从不结球白菜‘暑绿’中克隆到一个受热激诱导的小分子量热激蛋白(sHSP)基因,命名为BcHSP(DDBJ登录号为AB367955),该基因核苷酸序列全长722bp,编码157个氨基酸,与芜菁、芥蓝、拟南芥等有90%以上的相似性。实时定量检测表明,不结球白菜BcHSP转录表达受热激诱导,以叶片中表达量最高,BcHSP在不结球白菜叶片中表达特征说明它可能与植物叶片的耐热性关系更为密切。

白菜多聚半乳糖醛酸酶基因BcMF6的克隆、序列分析及其表达

从白菜(Brassica campestris L.ssp.chinensis Makino)核隐性不育两用系‘Bajh97-01A/B’可育株中分离得到的一个cDNA-AFLP差异片段入手,利用RACE技术成功克隆了一个花粉特异的多聚半乳糖醛酸酶(PG)基因BcMF6的DNA和cDNA全长序列,并对其序列进行了分析。结果表明,该基因包含4个外显子和3个内含子,最大开放阅读框为1194bp,编码397个氨基酸序列,对推导的氨基酸序列进行分析,1到22个氨基酸是1信号肽序列,其后有4个平行β螺旋重复(PbH1)结构,该序列包含3个N-糖基化位点,4个蛋白激酶c磷酸化位点,5个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,10个N-豆蔻酰化位点,1个PG活性位点(227RVTCGPGHGIS.IGS240)等。将BcMF6基因氨基酸序列与数据库中的其他PGs基因进行同源序列比对,构建系统进化树,发现该基因具有所有PGs基因特有的4个保守结构域,并且与花粉中特异表达的PG基因聚为一类,表明该基因是与花粉发育相关的多聚半乳糖醛酸酶基因。RT-PCR对其表达的研究表明,该基因在可育株(野生型)的中大蕾、开放花和短角果中特异表达,进一步表明该多聚半乳糖醛酸酶基因与白菜的花粉发育相关。

高温胁迫对不同耐热性菜心材料生理特性的差异研究

以4个耐热性存在差异的菜心品种(系)为试材,研究持续高温胁迫对菜心叶片中渗透调节物质、电解质渗漏率、活性氧的产生与清除的影响。结果表明:短期(1d)高温胁迫下,除过氧化氢酶(CAT)酶活性在耐热性弱的菜心材料中急剧增加,且达到活力最高值外,其它性状如脯氨酸和甜菜碱含量、电解质渗漏率、丙二醛(MDA)含量、O2.产生速率、H2O2含量、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)酶活性出现小幅度增加,且这些性状的值在4个菜心材料间差异不大;随着高温胁迫处理时间的延长(3～7d),生理指标在4个材料中呈现不同程度的增加,表现出耐热性强的材料的甜菜碱含量、SOD、POD和CAT酶活性均明显高于耐热性弱的材料,电解质渗漏率、MDA含量、O2.产生速率、H2O2含量则明显低于耐热性弱的材料;而脯氨酸含量的高低则未表现出与菜心耐热性强弱的对应关系。

白菜转录因子BcBHLHogu的克隆及其特征分析

【目的】探明白菜'矮脚黄'OguCMS核质互作的机制。【方法】采用cDNA-AFLP技术分析白菜'矮脚黄'OguCMS及其保持系花蕾基因的表达差异,获得一个在保持系早期花蕾不表达但在OguCMS早、中、晚花蕾中稳定表达的差异片段。利用RACE技术获得其cDNA全长,命名为BcBHLHogu(GenBank登录号:EF127860)。【结果】该基因编码122个氨基酸,具有basic helix-loop-helix(bHLH)结构域;进化分析表明,BcBHLHogu与拟南芥AtBHLH060同源性最高,是冗余基因AtBHLHs060/048的直系同源基因,其功能与BEEs1/2/3(3个油菜素内酯信号的早期应答冗余基因)相似。【结论】BcBHLHogu是白菜bHLH转录因子家族的一个新成员,涉及到花器官发育信号事件,其功能与油菜素内酯应答有关。

不结球白菜PR4蛋白基因的克隆与诱导表达分析

从不结球白菜抗病品种‘苏州青’中克隆到一个受SA和病原菌诱导的病程相关蛋白4(PR4)基因,命名为BcPR4(DDBJ登录号:AB325873),该基因核苷酸序列全长593 bp,编码140个氨基酸,与其它植物的PR4蛋白基因具有较高的相似性。系统进化树分析表明,该基因在不同物种之间具有保守性。基因组DNA杂交表明BcPR4属于多基因家族。实时定量PCR(qPCR)检测表明,SA和Peronospora parasitica均能诱导不结球白菜BcPR4转录表达,BcPR4在不结球白菜叶片中的表达特征说明它可能参与寄主对病原菌的抗性。

不结球白菜BcLRK01基因对芜菁花叶病毒及胁迫诱导的响应

通过cDNA-AFLP技术,从芜菁花叶病毒(TuMV)侵染的不结球白菜幼叶中分离到一条差异表达的基因片段,克隆获得其cDNA全长为2 124bp,编码707个氨基酸的富亮氨酸重复类受体激酶,命名为BcLRK01。利用实时定量PCR研究了该基因在TuMV侵染及高盐、冷胁迫、水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)、乙烯(ET)等处理下的表达情况,结果显示,TuMV侵染、高盐、冷胁迫、SA、JA和ET等均能诱导BcLRK01不同程度的表达,说明该基因可能是不结球白菜病毒病的病程相关基因,同时也参与高盐和冷胁迫以及SA、JA、ET等的信号途径。

30个不结球白菜品种的耐弱光性鉴定

用人工遮荫技术对不同来源的30个不结球白菜品种进行弱光处理,以干物质减少百分率、叶片厚度减少百分率和叶绿素a/b减少百分率3个指标作为评价标准,用系统聚类分析方法,将30个供试不结球白菜品种按其耐弱光性分为3类,即耐弱光性强、耐弱光性中等和不耐弱光品种。其中耐弱光性强的品种6个,占全部样品的20%;耐弱光性中等的品种15个,占50%;不耐弱光的品种9个,占30%。方差分析结果表明,3类品种间的耐弱光性指标差异极显著。其中,品种暑绿、正大抗热青3号、热优2号、抗热605、矮王、华王属于耐弱光品种。