nptⅡ::mgfp5融合基因的构建及其在柑桔遗传转化中的应用

早期、无损伤、易于操作的阳性芽检测技术,对提高柑橘遗传转化效率是十分有利的。本文设计和构建了nptⅡ：：mgfp5融合基因,通过锦橙上胚轴转化体系研究其在柑橘遗传转化中的作用。nptⅡ：：mgfp5融合基因全长1 578 bp,编码525个氨基酸,作为表达载体p1301NG的选择标记和报告基因。通过农杆菌介导法转化锦橙上胚轴,再生培养1周后用体式荧光显微镜观察外植体的再生情况。在再生培养第9天时即观察到GFP荧光再生芽的形成,再生培养后10~15 d是GFP再生芽形成的高峰期。GUS染色和PCR分子检测结果证明,GFP荧光检测结果是真实可靠的。研究结果表明：nptⅡ：：mgfp5融合基因能够在再生培养早期筛选到阳性转化芽,有助于提高阳性转化芽的存活率,提高柑橘遗传转化效率。

以nptⅡ为选择标记基因的转基因小麦高效筛选方法

采用两种方法筛选以npⅡt为选择标记基因的转基因小麦植株,结果表明,由未成熟种子获得的植株在无菌条件下进行卡那霉素筛选时（A方法）,50 mg/L的卡那霉素能有效抑制非转化小麦幼苗的正常生长;由成熟种子自然发芽获得的植株在滤纸上进行卡那霉素滴注筛选时（常规方法,B方法）,80～100 mg/L的卡那霉素能较好地抑制非转化小麦幼苗的正常生长。相对于B方法的常规筛选方法,A方法具有材料对卡那霉素敏感性高、筛选周期短而且筛选结果可靠性高等优点,是一种高效的以npⅡt为选择标记基因的转基因小麦的筛选方法。

nptⅡ：：gfp在锦橙遗传转化中转化效率的研究

绿色荧光蛋白基因(gfp)和新霉素磷酸转移酶基因(nptⅡ)被广泛应用于植物的遗传转化中。为了研究融合标记基因nptⅡ::gfp在锦橙遗传转化中的转化效率,经农杆菌介导法将CaMV35s组成型启动子驱动的nptⅡ::gfp融合标记基因表达载体pNGM和由CaMV35s启动子分别驱动nptⅡ、gfp两个基因的表达载体pNPTⅡ-GF转化至锦橙上胚轴内。GFP绿色荧光检测结果显示,gfp在转nptⅡ::gfp融合基因植株中强烈表达,荧光强度与转非融合nptⅡ和gfp基因植株的表达水平相当。nptⅡ::gfp融合标记基因在锦橙上的转化效率为10.8%,与非融合nptⅡ和gfp基因的转化效率(11.0%)无明显差异。nptⅡ::gfp融合标记基因是一个有效的锦橙遗传转化筛选标记基因。

利用标记基因检测转Bt基因棉种子纯度的研究

根据转Bt基因棉"国抗1号"转入的外源基因中整合有GUS基因和NPT 基因,建立了3种种子纯度检测方法:GUS组织化学染色法、NPT 培养基法和NPT 叶片涂抹法,准确率都达到98%以上;在检测转Bt基因棉原始群系"20-1"时与生物测定比较准确率也在98%以上,因此这3种方法可用于转Bt基因棉大规模制种过程中和推广过程中良种纯度的检测,相应方法同样适用于基因组中整合有GUS基因和(或)NPT 基因的其它转Bt基因棉的品种。

应用绿色荧光蛋白标记技术研究钙调激Ⅱ在HeLa细胞中的分布

采用绿色荧光蛋白 (GFP)标记技术研究钙离子钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ (CaMKⅡ )在HeLa细胞中的分布 .为了研究细胞内钙离子钙调素信号的下游作用物 ,我们首先构建了CaMKⅡ与GFP的融合基因 ,磷酸钙沉淀法将pCaMKⅡ -GFP重组载体导入HeLa细胞 .通过荧光显微镜观察 ,发现在细胞间期 ,CaMKⅡ -GFP融合蛋白主要分布于细胞核中 ,细胞质中亦有少量分布 ,这一分布不同于绿色荧光蛋白在间期细胞内的均匀分布 .同时讨论了与间接免疫荧光染色方法相比 ,GFP技术在功能蛋白定位研究上的应用优势 .