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PEDV Nsp10基因真核表达载体的构建及蛋白的表达
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作者 牛欣雨 郑亮 +4 位作者 魏佳琪 武峰峰 吴志军 张华 曹宏伟 《黑龙江八一农垦大学学报》 2023年第4期74-80,共7页
猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)为猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)的病原体。Nsp10是PEDV编码的一种非结构蛋白,在病毒的复制过程中发挥着重要的作用。为研究在病毒侵染宿主细胞时Nsp10蛋白发挥... 猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)为猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)的病原体。Nsp10是PEDV编码的一种非结构蛋白,在病毒的复制过程中发挥着重要的作用。为研究在病毒侵染宿主细胞时Nsp10蛋白发挥的作用,通过RT-PCR技术扩增Nsp10基因片段,利用同源重组的方法将Nsp10基因连接到pCMV-Myc载体,成功构建了PEDV Nsp10基因的真核表达载体。酶切鉴定及测序结果证实,PEDV Nsp10基因成功克隆到pCMV-Myc载体中,并将重组质粒命名为pCMV-Myc-Nsp10。将重组质粒pCMV-Myc-Nsp10通过脂质体转染至IPEC-J2细胞中,利用Western Blot和间接免疫荧光技术检测pCMV-Myc-Nsp10的表达以及定位情况。结果显示,pCMV-Myc-Nsp10在IPEC-J2细胞中成功表达,并且均匀分布在细胞质和细胞核中,为后续研究PEDV Nsp10蛋白的生物学功奠定了基础。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒 真核表达载体 nsp10蛋白 蛋白表达
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猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp10基因的克隆及序列分析 被引量:2
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作者 周思旋 周碧君 +3 位作者 隆华 朱时杰 文明 王开功 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2009年第10期10-13,共4页
根据猪繁殖与呼吸综合征病毒BJ-4序列,选择Nsp10基因保守区域设计并合成特异性引物,用RT-PCR方法扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒贵州地方株(命名为JL株)Nsp10基因片段,克隆到pMD18-T载体并测序,应用DNASTAR、C lustal_1.81和Mega序列分... 根据猪繁殖与呼吸综合征病毒BJ-4序列,选择Nsp10基因保守区域设计并合成特异性引物,用RT-PCR方法扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒贵州地方株(命名为JL株)Nsp10基因片段,克隆到pMD18-T载体并测序,应用DNASTAR、C lustal_1.81和Mega序列分析软件进行同源性比较。结果表明:贵州JL株Nsp10基因的cDNA长699 bp,可编码233个氨基酸;贵州JL株Nsp10基因与早期分离毒株MLV株、BJ-4株、VR-2332株、CH-1a株、CH2002株和GS2004株相应序列的核苷酸同源性为91.7%~94.0%,氨基酸同源性为97.4%~98.7%;而与最近分离毒株HN2007株、SX2007株、GD2007株、YN2008株、GS2008株、XL2008株、TJ株和JXA1株的核苷酸同源性为98.3%~98.6%,氨基酸同源性为99.6%~100%。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 nsp10基因 克隆 序列分析
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高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒JL株Nsp10基因生物信息学分析 被引量:3
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作者 周思旋 徐健 +1 位作者 周碧君 王开功 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2012年第1期6-10,共5页
本研究旨在对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)贵州JL株Nsp10基因(GenBank登录号:EU886322)进行生物信息学分析,了解其生物学特征,为下一步Nsp10的表达和ELISA检测方法的建... 本研究旨在对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)贵州JL株Nsp10基因(GenBank登录号:EU886322)进行生物信息学分析,了解其生物学特征,为下一步Nsp10的表达和ELISA检测方法的建立奠定基础。应用BioEdit、DNAStar、PsortⅡ、SignalP、TMHMM、ProtFun、Clustal_1.81、Mega等软件对Nsp10蛋白的理化参数、信号肽、跨膜区域、亲水性、表面可及性、抗原性、二级结构、亚细胞定位及与其他PRRSV毒株相应片段同源性等进行分析和预测。该蛋白理论分子质量为26.38ku,pI为8.93,为稳定蛋白,不含信号肽,无跨膜结构,具有良好的形成抗原表位的条件。亚细胞定位结果表明,该蛋白极有可能位于细胞质,其编码氨基酸序列与参考毒株同源性为97.4%~100%。该蛋白保守性较高,是可溶性蛋白,有良好的抗原性,具备作为靶蛋白建立免疫方法的条件。 展开更多
关键词 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒JL株 nsp10基因 生物信息学分析
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猪繁殖与呼吸综合征病毒JL株Nsp10的表达及鉴定
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作者 周思旋 徐健 +2 位作者 周碧君 文明 王开功 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第9期109-113,共5页
为获得猪繁殖与呼吸综合征病毒JL株非结构蛋白Nsp10,以克隆质粒pMD18-T-Nsp10/JL为模板,将Nsp10基因克隆至原核表达载体pET-32a,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,对不同温度和IPTG浓度进行优化,以获得Nsp10蛋白表达的最佳条件,采用SD... 为获得猪繁殖与呼吸综合征病毒JL株非结构蛋白Nsp10,以克隆质粒pMD18-T-Nsp10/JL为模板,将Nsp10基因克隆至原核表达载体pET-32a,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,对不同温度和IPTG浓度进行优化,以获得Nsp10蛋白表达的最佳条件,采用SDS-PAGE检测目的蛋白的表达情况,并通过Western blotting检测其免疫活性。结果表明,Nsp10基因成功克隆至pET-32a,有分子量约为43.4 kD的融合蛋白获得表达,重组蛋白于诱导4 h后达到高峰,IPTG浓度为0.2-1.2 mmol/L时,重组蛋白表达量无明显差异,Western blotting证实该表达蛋白具有反应原性。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 nsp10 表达
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猪繁殖和呼吸综合征病毒HuN4株nsp9、nsp10、nsp11对毒力影响的研究
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作者 姜一峰 周艳君 +5 位作者 王亚欣 朱建平 虞凌雪 徐彦召 童武 童光志 《中国动物传染病学报》 CAS 2011年第6期1-6,共6页
为研究高致病性猪繁殖和呼吸综合征病毒非结构蛋白对病毒毒力的影响,本研究通过反向遗传操作技术将高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4株的非结构蛋白编码区nsp9、nsp10、nsp11分别置换弱毒疫苗株HuN4-F112中的相应片段,经间接免疫荧... 为研究高致病性猪繁殖和呼吸综合征病毒非结构蛋白对病毒毒力的影响,本研究通过反向遗传操作技术将高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4株的非结构蛋白编码区nsp9、nsp10、nsp11分别置换弱毒疫苗株HuN4-F112中的相应片段,经间接免疫荧光鉴定拯救的重组病毒,分别命名为rHuN4-F112-nsp9、rHuN4-F112-nsp10、rHuN4-F112-nsp11,测序证实HuN4强毒nsp9、nsp10、nsp11片段正确替换入HuN4-F112骨架。拯救病毒在Marc-145细胞上的生长曲线显示,rHuN4-F112-nsp9和rHuN4-F112-nsp10在前24 h的复制速度明显高于rHuN4-F112-nsp11和拯救的母源毒rHuN4-F112,36 h后无明显差别。将拯救病毒以105TCID50剂量接种仔猪,对体温、临床症状、病毒血症、组织器官病变情况进行观察和检测。结果显示,拯救病毒rHuN4-F112-nsp9、rHuN4-F112 nsp10、rHuN4-F112 nsp11在致病性、发热以及病毒血症强度上与rHuN4-F112无显著差异,提示单独nsp9、nsp10、nsp11对病毒致病性以及病毒在体内的复制无影响。 展开更多
关键词 高致病性猪繁殖和呼吸综合征病毒 nsp9 nsp10 nsp11
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传染性支气管炎病毒非结构蛋白nsp10单克隆抗体的制备 被引量:1
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作者 雷静 凌吉飞 +1 位作者 周继勇 廖敏 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2014年第8期846-851,共6页
为了体外获得大量表达的传染性支气管炎病毒(IBV)的非结构蛋白10(nsp10)并制备其单克隆抗体,通过RT-PCR扩增获得了IBV nsp10基因,并将其克隆到原核表达载体pET-28a(+)中。重组载体pET-28a(+)-nsp10转化的表达宿主菌在1mmol/L IPTG诱导5... 为了体外获得大量表达的传染性支气管炎病毒(IBV)的非结构蛋白10(nsp10)并制备其单克隆抗体,通过RT-PCR扩增获得了IBV nsp10基因,并将其克隆到原核表达载体pET-28a(+)中。重组载体pET-28a(+)-nsp10转化的表达宿主菌在1mmol/L IPTG诱导5h获得高效表达。用纯化的重组蛋白Hisnsp10免疫小鼠制备单克隆抗体,采用有限稀释法经过3轮筛选和鉴定最终获得了2株分泌抗nsp10单克隆抗体的细胞株1G2和3G7。2株单克隆抗体在Western-blot分析中均与重组His-nsp10蛋白反应,并通过间接免疫荧光试验识别了4种不同毒株感染的DF-1细胞。IBV nsp10单克隆抗体的成功制备为IBV的检测和nsp10蛋白功能的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 传染性支气管炎病毒(IBV) 非结构蛋白10(nsp10) 单克隆抗体
原文传递
Identification of the strain-specifically truncated nonstructural protein 10 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in infected cells 被引量:1
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作者 ZHANG Zhi-bang XU Lei +5 位作者 WEN Xue-xia DONG Jian-guo ZHOU Lei GE Xin-na YANG Han-chun GUO Xin 《Journal of Integrative Agriculture》 SCIE CAS CSCD 2018年第5期1171-1180,共10页
The nonstructural protein 10(nsp10) of porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV) encodes for helicase which plays a vital role in viral replication. In the present study, a truncated form of nsp10... The nonstructural protein 10(nsp10) of porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV) encodes for helicase which plays a vital role in viral replication. In the present study, a truncated form of nsp10, termed nsp10 a, was found in PRRSV-infected cells and the production of nsp10 a was strain-specific. Mass spectrometric analysis and deletion mutagenesis indicated that nsp10 a may be short of about 70 amino acids in the N terminus of nsp10. Further studies by rescuing recombinant viruses showed that the Glu-69 in nsp10 was the key amino acid for nsp10 a production. Finally, we demonstrated that nsp10 a exerted little influence on the growth kinetics of PRRSV in vitro. 展开更多
关键词 porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV) nonstructural protein 10(nsp10 viral replication
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Ⅱ型猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白9和10中T细胞表位的定位
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作者 Parida R 吴艳 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2012年第9期155-155,共1页
猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是一种重要的猪病病原,呈现丰富的序列多样性。为了确定该病毒蛋白高度保守的T细胞表位,作者在PRRSV高度保守的非结构蛋白(NSPs)9和10的序列中查找了十七聚肽,它们能诱发免疫过Ⅱ型PRRSV FL-12株的猪外周... 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是一种重要的猪病病原,呈现丰富的序列多样性。为了确定该病毒蛋白高度保守的T细胞表位,作者在PRRSV高度保守的非结构蛋白(NSPs)9和10的序列中查找了十七聚肽,它们能诱发免疫过Ⅱ型PRRSV FL-12株的猪外周血单个核细胞增殖和干扰素-γ的反应。通过研究确定了4条可能含有T细胞表位的多肽,NSP9和NSP10各2条。将这4条多肽的氨基酸序列与不同的Ⅱ型PRRSV毒株的类似序列进行比对,结果表明这些序列高度保守,由此可推断含有高度保守的T细胞表位。已确定的抗原表位对免疫原组成十分重要,可以提供针对不同PRRSV毒株的广泛交叉保护。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征 NSP9 nsp10 T细胞表位
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